徐環(huán)，董蘇潔，趙振楠，蘇苗，錢麗敏，宋淇淇

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天津市區(qū)公園土壤樣品中弓形蟲污染情況的調查

徐環(huán)，董蘇潔，趙振楠，蘇苗，錢麗敏，宋淇淇通信作者

（天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學院，天津 300384）

對天津市區(qū)不同公園土壤樣品中弓形蟲卵囊的污染情況進行調查，選取弓形蟲的高拷貝DNA片段B1基因作為診斷基因，以天津市內六區(qū)共35個公園及5所高校的土壤樣品作為研究對象，提取土壤樣品中的基因組DNA，利用PCR方法對春夏季節(jié)以及秋冬季節(jié)的土壤樣品中弓形蟲卵囊的污染情況進行檢測。結果表明：春夏季節(jié)土壤樣品中弓形蟲卵囊的陽性率為11.11%（10/90），秋冬季節(jié)土壤樣品中弓形蟲卵囊的陽性率為2.22%（2/90），弓形蟲卵囊污染情況呈季節(jié)性變化，從春夏季節(jié)到秋冬季節(jié)呈逐漸下降的趨勢。

弓形蟲；天津市區(qū)；公園；土壤樣品；污染

弓形蟲病是一種呈全球性分布的重要食源性人獸共患寄生蟲病。此病呈世界性分布，全球人群弓形蟲的感染率約為25%～50%，有些地區(qū)感染率高達80%以上，估計全世界有約5億～10億人感染過弓形蟲[1]。該病在流行病學上具有兩大特點：一、廣泛流行性，即除南極洲外，世界各大洲都有流行，是一種全球性寄生蟲??；二、多宿主性，弓形蟲可侵襲所有哺乳動物、鳥類、爬行類和冷血動物等。孕婦感染弓形蟲病可引起早產(chǎn)、流產(chǎn)，甚至死胎[2]；艾滋病患者感染可導致嚴重的并發(fā)癥，甚至死亡；動物感染表現(xiàn)為免疫力低下、生長緩慢、消瘦、貧血等，嚴重時也可導致死亡[3]。由此，弓形蟲對人類社會構成兩大威脅，一是對人類健康和優(yōu)生優(yōu)育造成嚴重威脅，二是引起豬、羊等多種家畜流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙性疾病，給畜牧業(yè)造成巨大損失[4]。

弓形蟲病有多種傳播途徑，其中被弓形蟲卵囊所污染的土壤被認為是弓形蟲病的主要傳染源之一，因此對土壤中弓形蟲污染情況進行調查對控制弓形蟲病的傳播具有一定的公共衛(wèi)生學意義。本項目以天津市區(qū)各大公園的土壤樣品為研究對象，用PCR方法對不同季節(jié)土壤樣品中弓形蟲卵囊的污染情況進行檢測，從而對天津市區(qū)公園土壤中弓形蟲的感染現(xiàn)狀進行分析，將有助于人們進一步重視該病，并為該病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

天津市內六區(qū)35個公園以及5所高校的土壤樣品。

1.1.2 主要試劑

土壤基因組提取試劑盒（美國OMEGA公司）；瓊脂糖（上海捷瑞生化科技有限公司）；DNA聚合酶（Takara公司）；dNTPs（Takara公司）；DNA Marker（北京全式金生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品的采集

2017年5月在天津市區(qū)38個公園及7所高校共采集春夏季土壤樣品90份，具體采樣地點見表1。

表1 天津市內六區(qū)具體采樣地點

在此次樣品采集中每個采樣地點各采集土壤樣品兩份。每份樣品采集地表至地下5 cm的土壤，在所選區(qū)域采集5個點進行混合，生成一份土壤樣品代表該區(qū)域的土壤檢測樣本，并對該采集樣本的所在地進行樣本的記錄備注[4]。2017年11月在采樣地點再次采集秋冬樣品90份，方法同上。

1.2.2 土壤樣品的預處理

土壤中含有大量的雜質，如較大的石塊、植物的根莖、煙頭等都有可能混合于土壤樣本中，樣本采集區(qū)土壤環(huán)境的干燥與濕潤情況也會影響試驗。因此需要對土壤樣品進行風干與篩選。將所采集回來的樣品平鋪在干凈的紙上，置于干燥陰涼的地方通風，經(jīng)常翻動使樣品加速干燥。此步驟是為了確保實驗中能夠加入足量的土壤樣品，而不受土壤中水分的影響。

當樣品干燥后對其進行過篩。首先將樣品中較大的土塊對其進行粉碎，釋放出可能被包含在其中的弓形蟲卵囊，然后將所研磨粉碎過的土壤經(jīng)過10目篩篩選[5]。經(jīng)篩后的土壤樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 土壤樣品基因組DNA的提取

（1）稱取0.5 g玻璃珠加入1.5 mL離心管中，然后再稱取0.7 g土壤樣品加入到該離心管中，再向該離心管中加入試劑盒中的SLX-Mlus Buffer試劑1 mL，渦旋以裂解樣品；

（2）向渦旋過的離心管再加入DS Buffer進行短暫的渦旋使其完全混合；

（3）將離心管置于70 ℃水浴鍋中水浴10 min，在水浴過程中進行短暫渦旋；

（4）室溫3 000 g離心3 min。離心完畢后將試管小心取出，切勿打亂沉淀；

（5）轉移800 μL上清液置于新的2 mL離心管中，然后向其中加入270 μL P2 Buffer，將其渦旋使其完全混合；

（6）將渦旋好的2 mL離心管于冰上孵育5 min；

（7）4 ℃以13 000 g離心5 min；

（8）小心將上清液轉移至新的2 mL離心管中；

（9）向離心管中加入0.7倍體積的異丙醇，反復顛倒20～30次使其與上清液完全混合；

（10）4 ℃以13 000 g離心10 min，小心棄去上清液；

（11）將離心管倒扣于吸水紙上約1 min，使其吸去管中的液體；

（12）向管中滴加200 μL Elution Buffer后渦旋10 s。再在水浴鍋中孵育10～20 min以溶解DNA沉淀；

（13）加入HTR試劑（該試劑在使用之前應垂懸混勻）100 μL。渦旋混勻。并在室溫下放置2 min；

（14）以13 000 g離心2 min。將清亮的上清液轉移到新的2 mL離心管中；

（15）加入等體積的XP1 Buffer試劑，渦旋以混勻；

（16）將上步中渦旋后的液體加入到HiBind DNA Mini Column管中；

（17）在室溫下以10 000 g離心1 min。棄去濾液，但Collection Tube不能棄去；

（18）再向HiBind DNA Mini Column管中加入300 μL XP1 Buffer試劑；

（19）10 000 g離心1 min，棄去濾液以及Collection Tube管；

（20）將HiBind DNA Mini Column管轉移到新的2 mL Collection Tube管上；

（21）向HiBind DNA Mini Column管加入700 μL SPW Wash Buffer試劑，10 000 g離心1 min；

（22）棄去濾液，但Collection Tube保留；

（23）重復步驟21～22，進行二次洗滌；

（24）將空的HiBind DNA Mini Column管在室溫下于13 000 g離心2 min；

（25）轉移HiBind DNA Mini Column至新的1.5 mL離心管上。加入100 μL已在70 ℃水浴鍋預熱的Elution Buffer試劑于HiBind管的洗脫膜中央，65 ℃水浴5 min；

（26）13 000g離心1 min以洗脫DNA；

（27）重復25～26步驟，進行二次洗膜；

（28）棄去HiBind DNA Mini Column管，將所獲得的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR引物的合成及PCR擴增體系

擴增所采用的基因序列為弓形蟲的B1基因[6]。其引物序列如表2所示。

表2 PCR擴增引物序列

向0.2 mL小管中加入10×PCR Buffer、上游引物、下游引物、dNTPs、DNA模板、聚合酶，最后加入ddH2O將其總反應體系補齊至25 μL。放至離心機中進行短暫的離心。陽性對照為弓形蟲的DNA基因組，陰性對照為重蒸水。擴增體系見表3。除此之外，還要向擴增體系中加入終濃度為400 ng/μL的BSA，以抑制土壤樣品中可能存在的PCR擴增抑制因子。

表3 PCR反應的擴增體系 μL

1.2.5 PCR反應程序及PCR擴增產(chǎn)物的檢測

PCR反應程序：（1）95 ℃預變性10 min；（2）94 ℃變性30 s；（3）54 ℃退火30 s；（4）72 ℃延伸30 s；（5）重復步驟（2）（3）（4）共30個循環(huán)；（6）72 ℃過延伸10 min；（7）15 ℃保溫。擴增結束后進行凝膠電泳檢測，或置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測：取PCR擴增產(chǎn)物5～8 μL加入至1.5%瓊脂糖凝膠樣品孔中，通電后進行電泳，待電泳結束后，在凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

1.2.6 PCR擴增產(chǎn)物的測序

將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切割下帶有單一目的片段的凝膠塊，利用試劑盒進行DNA回收。將回收產(chǎn)物與T載體進行連接，轉化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉化后的菌液涂布于培養(yǎng)皿中，8～12 h后觀察菌落形態(tài)。于超凈臺將單個陽性菌落挑下后對其進行PCR鑒定，對鑒定正確的陽性菌株進行測序。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

電泳檢測結果如圖1所示，檢測結果顯示，在90份秋冬季節(jié)土壤樣品中有2份樣品成功擴增出194 bp目的條帶。

圖1 弓形蟲卵囊B1基因的PCR擴增圖

注：M為DNA Marker；1，2為PCR檢測陽性結果；3為陰性對照；4為陽性對照

2.2 PCR擴增產(chǎn)物的測序結果

PCR擴增產(chǎn)物的測序結果如下：

5＇-TATAAGA AAAAAATGTGGGAATGAAAGAGACGCTAATGTGTTTGCATAGGTTGCAGTCACTGACGAGCTCCCCTCTGCTGGCGAAAAGTGAAATTCATGAGTATCTGTGCAACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTCGCCTGCAATCGATAGTT-3＇

產(chǎn)物長度為194 bp，將此序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中所報道的弓形蟲B1基因序列相比對，符合率為100%。

2.3 不同季節(jié)土壤中PCR檢測結果

90份春夏季土壤樣品中共檢測到10份陽性樣品，陽性率為11.11%（10/90）；90份秋冬季土壤樣品中共檢測到2份陽性樣品，陽性率為2.22%（2/90）。

3 討論

目前用PCR方法檢測弓形蟲的靶基因有P30基因、B1基因以及529 bp片段等，其中B1基因和529 bp片段在檢測中最為常用。B1基因是由Burg等[7]對RH株弓形蟲基因文庫進行篩選得到的大小為2.2 kb、大約有35拷貝的片段，此序列高度保守，有高度敏感性和特異性。529 bp片段是由Homan等[8]鑒定出的弓形蟲基因組中重復200～300次的基因片段。在本次試驗中，采用B1基因作為此次PCR方法的診斷基因。

近幾年來，關于土壤中弓形蟲的報道各有差別，陽性率也相差較大。人們發(fā)現(xiàn)，隨著研究的深入，弓形蟲病的流行表現(xiàn)出許多新特點，危害遠遠高出人們的估計。從此次調查結果來看，天津市各大公園和高校土壤樣品弓形蟲卵囊檢測顯示，秋冬季陽性率2.22%（2/90），春夏季陽性率11.11%（10/90），說明了公園土壤中弓形蟲卵囊污染情況呈季節(jié)性變化，并且土壤一年四季都受到弓形蟲卵囊的污染，且從春天到秋天呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。因此，春夏季可能具有較高的通過土壤感染弓形蟲的幾率[9]。

研究表明，弓形蟲感染呈世界性分布，特別集中于溫暖、潮濕和低海拔地區(qū)，卵囊在溫暖、干燥的環(huán)境中存活率會下降[10]。在波蘭的人類弓形蟲病流行病學中，被弓形蟲卵囊污染的土壤可能會對人和動物造成一定的危害，不同地區(qū)土壤弓形蟲陽性率的差異和當?shù)氐臍夂驐l件、衛(wèi)生狀況及戶外活動頻繁程度均有一定的關系[11]。國內有學者對湖北武漢地區(qū)部分公園的土壤樣品中弓形蟲卵囊的污染情況進行了調查，冬季樣品的弓形蟲卵囊陽性率為6.35%（6/53）[12]，蘭州市公園土壤夏季弓形蟲陽性率12.0%[13]。而根據(jù)此次的調查結果，天津地區(qū)公園冬季的弓形蟲卵囊陽性率要低于之前的報道。其原因可能在于南北方的氣候差異，天津市地理位置相對緯度高，相比湖北的冬季氣候環(huán)境，天津的冬季氣溫處于0℃以下，土壤發(fā)生凍結，其土壤的環(huán)境可能不適合弓形蟲卵囊的生存，使得此次弓形蟲檢測的陽性率很低，僅為2.22%；而天津春夏季節(jié)氣候溫暖且少雨，與蘭州春夏季氣候相差不大，以至于其陽性率相近。雖然是說冬季陽性率偏低，但是在檢測中，也同樣檢測到了弓形蟲卵囊的存在，說明天津市公園土壤中也同樣有弓形蟲的存在，并且對周圍市民以及動物的生活產(chǎn)生了一定的健康隱患。同時在沒有檢測到的地區(qū)也不能說該地區(qū)沒有弓形蟲的存在，有可能在采集樣品中剛好未采集到含有弓形蟲卵囊的土壤，或者采集樣品中以前可能存在過弓形蟲的卵囊，只是卵囊可能已經(jīng)死亡崩解，使檢測結果呈現(xiàn)陰性。

總之，本研究表明天津市各大公園和高校的土壤中存在弓形蟲卵囊，為土壤可能是人和動物感染弓形蟲的傳染源提供了可靠的證據(jù)。因此，對土壤中弓形蟲卵囊的監(jiān)測是減少人和動物受弓形蟲感染的有效措施。弓形蟲感染已日益受到人們的關注，應增強預防意識，大力普及本病知識，提倡健康理念，保持良好的生活習慣和飲食方式，注意生活衛(wèi)生，切斷傳染源，從根本上預防弓形蟲病的發(fā)生。

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責任編輯：張愛婷

Investigation ofcontamination in soil samples of parks in urban areas of Tianjin city

XU Huan, DONG Su-jie, ZHAO Zhen-nan, SU Miao, QIAN Li-min, SONG Qi-qiCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to investigate the contamination status ofin soil samples of parks in urban areas of Tianjin city, high copy DNA fragment B1 gene ofwas selected to be the diagnostic gene, and soil samples from thirty five parks and five universities were studied as research objects. Genomic DNA was extracted from the soil samples, and the contamination status ofoocyst in soil samples from spring-summer months and autumn-winter months were detected by PCR method. The results showed that the positive rate of soil samples from spring-summer months was 11.11%（10/90）, while the positive rate of soil samples from autumn-winter months was 2.22%（2/90）. The contamination ofwas seasonal, and there is a downward trend from spring-summer months to autumn-winter months.

; urban areas of Tianjin city; parks; soil samples; contamination

1008-5394（2018）04-0048-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.04.011

S855.9

A

2018-05-14

天津市教委科研計劃項目（2018KJ185）；天津農學院大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（201710061186）；天津農學院科學研究發(fā)展基金（2014N10）；國家自然科學基金項目（31702223）

徐環(huán)（1998-），女，本科在讀，主要從事動物醫(yī)學方面的研究。E-mail：1377924594@qq.com。

宋淇淇（1986-），女，講師，博士，主要從事獸醫(yī)寄生蟲學教學及研究工作。E-mail：qqs0606@163.com。