徐偉，陳翠婷，馬婷婷，柴麗娜

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076)

來(lái)源于低溫環(huán)境的微生物，其可在0～5 ℃生長(zhǎng)繁殖，最高生長(zhǎng)溫度在20 ℃ 以上，被稱為耐冷微生物[1]。目前對(duì)中溫型乳酸菌的研究較多，而對(duì)低溫乳酸菌的研究尚少。其能適應(yīng)低溫環(huán)境的主要原因是，在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過(guò)程中，形成了細(xì)胞膜的生物功能、能量產(chǎn)生及傳遞系統(tǒng)、蛋白質(zhì)的生物合成、酶類和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等一系列復(fù)雜的冷適應(yīng)機(jī)制[2]。乳酸菌可以抑制環(huán)境中的其他微生物，主要是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、競(jìng)爭(zhēng)附著點(diǎn)使其他微生物不能定值[3]。乳酸菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)包括乳酸、乙酸等酸性物質(zhì)，過(guò)氧化氫、乳酸菌素等可以抑制其他微生物的生長(zhǎng)[4]。

目前，罐藏食品會(huì)由于某些化學(xué)或物理原因引起腐敗變質(zhì)，而引起腐敗變質(zhì)的主要原因是由微生物而導(dǎo)致的腐敗變質(zhì)，其中酵母菌可引起水果、果醬等的敗壞，從中分離出的酵母主要有球擬酵母(Torulopsis)、假絲酵母(Candida)和啤酒酵母(S.cerevisiae)等[5]。因此，能夠篩選出產(chǎn)生抑菌物質(zhì)并應(yīng)用于食品保鮮的耐低溫的微生物菌株，為天然抑菌物質(zhì)的應(yīng)用開(kāi)辟更廣闊的前景，為生物抑菌劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸菜發(fā)酵液：從哈爾濱周邊地區(qū)采集冬季低溫貯藏的酸菜發(fā)酵液樣品20份。

1.1.2 菌種

大腸桿菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、啤酒酵母(S.cereviisae)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)：均由哈爾濱商業(yè)大學(xué)微生物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試劑

牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂等：均為生物試劑；葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等：均為分析純；苯乳酸、乙酸、乳酸、丙酸：Sigma公司;MRS培養(yǎng)基、液體分離培養(yǎng)基：按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D型單人單面凈化工作臺(tái) 浙江蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-70F型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-50XB型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海中安醫(yī)療器械廠；YS2-H型顯微鏡 Nikon China；BS 224S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；723N型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司；Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R臺(tái)式高速低溫離心機(jī) Thermo公司[7]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離、純化

稱取適量樣品用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，10-1～10-7濃度梯度，分別吸取200 μL稀釋液涂布于MRS分離培養(yǎng)基上10 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑取菌落顏色由黃到淡黑色的單菌落，進(jìn)一步分離純化。所得純菌株經(jīng)革蘭氏染色和接觸酶實(shí)驗(yàn)，選取革蘭氏陽(yáng)性菌和接觸酶陰性菌，將所得純菌株標(biāo)號(hào)并保藏。

1.3.2 菌株的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)[8]。

1.3.2.2 生理生化鑒定

主要采用接觸酶實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定，具體方法參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]。

1.3.2.3 16S rDNA基因的分子生物學(xué)鑒定

吸取10 ℃條件下培養(yǎng)12 h的CCT-1菌株發(fā)酵液1 mL，9000 r/min離心2 min，沉淀用于DNA提取，具體的操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。PCR選用細(xì)菌16S rRNA通用引物(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)：上游引物：5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和下游引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系包括：10×Buffer，2.5 μL，2.5 μmol/L dNTP，1 μL引物各0.5 L，DNA模板1 μL，ddH2O，25 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性，94 ℃，4 min；變性，94 ℃，45 s；退火，55 ℃，45 s；延伸，72 ℃，1 min，共30個(gè)循環(huán)。PCR純化產(chǎn)物送樣測(cè)序：生工生物工程(上海)股份有限公司。

用BLAST將所測(cè)定菌株的16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，分析相似性[10]。然后用MEGA 6.0中的Clustal對(duì)最近類群的序列進(jìn)行多重比較分析，并通過(guò)該軟件的鄰近法(neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分支聚類的穩(wěn)定性用Bootstrap方法進(jìn)行1000次隨機(jī)重復(fù)取樣評(píng)價(jià)[11]。

1.3.3 CCT-1和YY菌株的生長(zhǎng)曲線

將CCT-1和YY菌株以3%的接種量接入已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于10 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)108 h；每隔12 h取2菌株的發(fā)酵液，在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定2個(gè)樣品的吸光度值(OD值)、培養(yǎng)液的pH值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值、pH值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線。

1.3.4 CCT-1菌株對(duì)4種指示菌的抑菌性研究

采用雙層平板法，底層為MRS固體培養(yǎng)基(10 mL/皿)，待下層平板凝固，在平板中央平行畫2條直線，于10 ℃培養(yǎng)24 h。高溫滅菌4種指示菌的半固體培養(yǎng)基(LB、查氏、牛肉膏蛋白胨和YPD)，待溫度冷卻至50 ℃左右時(shí)，按2%的接種量加入敏感指示菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、啤酒酵母)菌液，混合均勻后立即倒入上層平板鋪平，于指示菌最適生長(zhǎng)溫度培養(yǎng)24 h，觀察現(xiàn)象。

1.3.5 CCT-1菌懸液濃度對(duì)指示菌的抑菌效果研究

將CCT-1菌株于10 ℃培養(yǎng)24 h，待菌懸液細(xì)胞濃度為106cfu/mL時(shí)，將菌懸液稀釋1，2，3倍濃度。先將指示菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、啤酒酵母)菌液在相應(yīng)固體平板上進(jìn)行涂布，然后采用牛津杯法，按未經(jīng)稀釋、稀釋1倍、稀釋2倍、稀釋3倍的濃度梯度，加CCT-1菌株發(fā)酵液2.5 μL，于各指示菌生長(zhǎng)的最適溫度恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑[12]，測(cè)定菌懸液細(xì)胞濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐低溫乳酸菌的分離篩選

從哈爾濱周邊采集的冬季低溫貯藏的酸菜發(fā)酵液中，共得到25株革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫陰性的乳酸菌菌株。經(jīng)過(guò)限定培養(yǎng)溫度10 ℃，篩選得到7株耐低溫的乳酸菌菌株，其中菌株CCT-1的生長(zhǎng)狀況最好，因此選取菌株CCT-1為實(shí)驗(yàn)菌株。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

將菌株CCT-1在固體MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，觀察菌株在平板上的單菌落形態(tài)呈圓形，隆起，表面光滑，濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊，顏色為乳白色(見(jiàn)圖1中a)。細(xì)菌革蘭氏染色呈陽(yáng)性，桿狀(見(jiàn)圖1中b)。

圖1 CCT-1菌株菌落圖和CCT-1革蘭氏染色圖

2.2.2 菌株生理生化鑒定結(jié)果

CCT-1菌株生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 CCT-1菌株生理生化鑒定結(jié)果

續(xù) 表

注：“+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性。

由表1可知，革蘭氏染色、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，精氨酸產(chǎn)氨、接觸酶實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、明膠液化、V-P實(shí)驗(yàn)呈陰性。結(jié)合菌落特征和生理生化特征，初步鑒定CCT-1為植物乳桿菌。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登錄NCBI網(wǎng)站，用BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)，并利用MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。發(fā)現(xiàn)CCT-1與植物乳桿菌的16S rDNA同源性達(dá)99%以上，這與形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果一致，由此可以進(jìn)一步將CCT-1菌株歸屬于植物乳桿菌(L.plantarum)。

圖2 菌株CCT-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)關(guān)系圖

2.3 CCT-1和植物乳桿菌的生長(zhǎng)性能

將植物乳桿菌與菌株CCT-1按3%的接種量，分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于10 ℃恒溫培養(yǎng)108 h，每隔12 h，分別測(cè)得植物乳桿菌和CCT-1 2菌株在波長(zhǎng)600 nm下的吸光度值(OD值)及培養(yǎng)液的pH值，繪制生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 CCT-1和植物乳桿菌在10 ℃培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線

由圖3可知，菌株CCT-1和植物乳桿菌在10 ℃條件下培養(yǎng)108 h后，CCT-1菌株在24 h后菌體量開(kāi)始快速增加(P<0.05)，同時(shí)發(fā)酵液的pH值顯著降低(P<0.05)，菌株在培養(yǎng)60 h后菌體量和發(fā)酵液pH值都趨于穩(wěn)定(P>0.05)，OD600為0.632，從整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程可知菌株CCT-1在10 ℃條件下生長(zhǎng)良好，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，pH降到3.7左右[13]；植物乳桿菌在48 h后菌體量開(kāi)始增加，同時(shí)發(fā)酵液的pH值降低，菌株在培養(yǎng)72 h后菌體量和pH都趨于穩(wěn)定，OD600為0.365。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是植物乳桿菌難以適應(yīng)低溫的環(huán)境，延滯期過(guò)長(zhǎng)；低溫條件下，植物乳桿菌的生長(zhǎng)速度緩慢，導(dǎo)致菌體量過(guò)低。

2.4 CCT-1菌株對(duì)4種指示菌的抑菌性研究結(jié)果

乳酸菌在環(huán)境中可以抑制其他微生物的生長(zhǎng)，主要通過(guò)與其他微生物之間競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以同有害菌競(jìng)爭(zhēng)附著點(diǎn)，使其他微生物不能定值而被流失。

分別用MRS與LB、查氏、牛肉膏蛋白胨和YPD半固體培養(yǎng)基的雙層平板對(duì)峙法，研究CCT-1對(duì)4種指示菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、啤酒酵母)的抑菌性，抑菌效果見(jiàn)圖4。

圖4 CCT-1對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、啤酒酵母的抑菌效果圖

由圖4可知，CCT-1對(duì)4種指示菌均有明顯的抑制作用，對(duì)啤酒酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈明顯，抑菌效果最好；對(duì)黑曲霉的抑菌圈不明顯，抑菌效果弱。產(chǎn)生這種明顯抑菌效果的原因可能是，CCT-1菌株與啤酒酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，消耗了3種指示菌所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而促進(jìn)自身的生長(zhǎng)，或者是菌株CCT-1產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有機(jī)酸等抑菌物質(zhì)抑制了3種指示菌的生長(zhǎng)繁殖。CCT-1與黑曲霉的生長(zhǎng)過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力不及黑曲霉，導(dǎo)致抑菌圈效果不明顯。

2.5 CCT-1菌株菌懸液稀釋液對(duì)4種指示菌的抑菌性研究結(jié)果

采用牛津杯法，將CCT-1菌株發(fā)酵液，加液量為2.5 μL，以稀釋1倍、稀釋2倍、稀釋3倍、未經(jīng)稀釋發(fā)酵液做對(duì)照，研究CCT-1菌株發(fā)酵液稀釋液對(duì)4種指示菌的抑菌性，測(cè)定抑菌圈直徑，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 CCT-1菌懸液稀釋液對(duì)4種指示菌抑菌圈直徑變化圖

注：牛津杯內(nèi)徑為6 mm，外徑為8 mm。

由圖5可知，CCT-1菌株發(fā)酵液隨著稀釋倍數(shù)的增大，對(duì)4種指示菌的抑菌圈直徑變小(P<0.05)，抑菌性減弱。當(dāng)菌懸液稀釋倍數(shù)為3倍時(shí)，啤酒酵母的抑菌圈直徑與未稀釋的抑菌圈直徑相比減少了3 mm，此時(shí)的抑菌圈直徑為10 mm；大腸桿菌的抑菌圈直徑與未稀釋的抑菌圈直徑相比減少了2.2 mm，此時(shí)的抑菌圈直徑為9.8 mm；枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑與未稀釋的抑菌圈直徑相比減少了1.5 mm，此時(shí)的抑菌圈直徑為9 mm；黑曲霉的抑菌圈直徑與未稀釋的抑菌圈直徑相比減少了1.5 mm，此時(shí)的抑菌圈直徑為8.5 mm。此時(shí)的菌懸液仍有抑菌活性，細(xì)胞濃度3.4×106cfu/mL即CCT-1菌株的最低抑菌濃度。造成這種現(xiàn)象的原因是，隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增大，菌懸液細(xì)胞濃度或發(fā)酵液中產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)減少，所以抑菌效果減弱。

3 結(jié)論

本研究從東北冬季貯藏的酸菜發(fā)酵液中分離到的耐低溫乳酸菌經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)的鑒定，確定其為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。利用雙層平板法研究CCT-1菌株對(duì)4種指示菌的抑菌性，通過(guò)效果圖可以看出，對(duì)酵母菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果非常顯著，產(chǎn)生抑菌作用的原因是CCT-1與4種指示菌在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成指示菌缺少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從而抑制了指示菌的生長(zhǎng)。通過(guò)牛津杯法研究CCT-1菌株發(fā)酵液未經(jīng)稀釋、稀釋1倍、稀釋2倍、稀釋3倍，測(cè)定4種指示菌的抑菌圈直徑。結(jié)果顯示：當(dāng)CCT-1菌懸液細(xì)胞濃度為3.4×106cfu/mL時(shí)，酵母菌的抑菌圈直徑為10mm，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉的抑菌圈直徑分別為9.8，9，8.5mm。隨著稀釋倍數(shù)的增大，對(duì)于指示菌的抑菌作用減小，造成這種現(xiàn)象的原因是隨著稀釋倍數(shù)的增大，菌懸液中的菌體量及產(chǎn)生的代謝物都減少，因此抑菌作用減小。