周孝文 劉錦濤 俞 峰

江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科 215003

腰椎間盤突出癥是引起腰腿疼痛常見疾病之一，部分患者存在突出組織重吸收現(xiàn)象，為此國內(nèi)外學者進行了大量相關研究，現(xiàn)有研究表明P38MAPK信號通路與機體炎癥反應關系密切，為探討益氣活血方與該通路在突出組織重吸收方面的關系，進行了本次實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 P38MAPK特異性阻斷劑：SB203580，SelleckChemicals公司，No:S1076。中藥益氣活血方(蘇州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供)組成：生炙黃芪20g、威靈仙10g、川芎15g、木瓜10g、地龍15g、防己10g、當歸10g、白芥子6g、水蛭6g。置于500ml常溫水中浸泡30min，煎煮(火力2 100W)開鍋后煎30min取汁200ml；再加水300ml煎30min取汁200ml兩次相兌并濃縮成1.5g/ml煎劑保存于恒溫冰箱中。

1.2 實驗室動物 選擇3月齡SPF級Sprague-Dawlay(SD)雌性大鼠80只，由上海Slac實驗動物有限責任公司(中科院上海分院)提供，合格證號：SCXX(滬)2015-0005。

1.3 動物造模 以鹽酸氯胺酮(0.10g/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，去除背部體毛，橡皮筋扎住尾巴根部，常規(guī)消毒，每只大鼠切取第3、4尾椎椎間盤(包含上下軟骨終板)。用10ml注射器針頭刺破所取椎間盤正中纖維環(huán)暴露髓核，用電子天平(萬分之一單位)稱其重量，游標卡尺測量體積。碘伏常規(guī)消毒背部，后正中線切開皮膚、肌肉、將取出的椎間盤植入肌肉層，隨后逐層縫合，紅霉素眼膏涂擦切口，造模成功后將大鼠放入籠中常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 分組 選擇80只3月齡SD雌性大鼠，制作破裂型椎間盤突出模型，采用完全隨機實驗設計分為破裂模型組(對照組)、中藥組、P38阻斷劑組和P38阻斷劑+中藥組四組，每組20只。

1.5 干預方法 于造模后第2天，各組均以9.1ml/kg劑量1次/d進行灌喂；對照組予生理鹽水灌喂+鞘管內(nèi)注射2% DMSO(10mg/kg)；中藥組予益氣活血方煎液灌喂+鞘管內(nèi)注射2% DMSO(10mg/kg)；P38阻斷劑組予生理鹽水灌喂+鞘管內(nèi)注射P38MAPK的阻斷劑 SB203580(10mg/kg)；中藥+P38阻斷劑組予益氣活血方煎液灌喂+鞘管內(nèi)注射P38MAPK的阻斷劑 SB203580(10mg/kg)；1次/d，直至取材之日。

1.6 取材與處理 造模結(jié)束后正常飼養(yǎng)，于1周和4周后各組分別取10只大鼠，將其麻醉，沿原手術(shù)切口打開背部肌肉，逐層分離組織，找到包埋的椎間盤，取出后迅速用電子天平稱重、游標卡尺測量直徑及高度。測量完畢后將椎間盤分為2份分別標號：一份放入10%的中性甲醛固定液中進行固定24h，預留做石蠟標本。另一份用0.01mmol/L PBS磷酸緩沖鹽溶液洗去血漬后放入已標記的無菌EP管中，于-80℃冰箱中保存。預留用于Real Time PCR、Western Blot等檢測。

1.7 檢測指標 分別以電子天平、游標卡尺測量椎間盤質(zhì)量(g)和體積(mm3)，采用Real Time PCR檢測血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF) 、腫瘤壞死因子-α(Tumour necrosis factor-α) 、白介素-1β(Interleukin-1β)、金屬基質(zhì)蛋白酶-3(Matrix metallo proteinases-3)、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(Matrix metallo proteinases-9)及P38MAPK的mRNA表達，以蛋白質(zhì)印記法(Western Blot)檢測P38MAPK、P-p38MAPK、TNF-α、IL-1β、VEGF、MMP-3、MMP-9的蛋白表達。質(zhì)量、體積差計算方法:1周(mg)=造模前(mg)-造模后1周(mg)；4周(mg)=造模前(mg)-造模后4周(mg)。1周(mm3)=造模前(mm3)-造模后1周(mm3)；4周(mm3)=造模前(mm3)-造模后4周(mm3)。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用(x±s)表示，正態(tài)分布用t檢驗，兩組間差異采用獨立樣本t檢驗，組間差異采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布使用秩和檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 椎間盤質(zhì)量、體積變化 各組椎間盤質(zhì)量和體積變化比較：1周末，中藥組質(zhì)量、體積減少值明顯高于其他組，P38阻斷劑組各時間段質(zhì)量減少值小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4周末，中藥組質(zhì)量、體積減少最明顯，P38阻斷劑組、中藥+P38阻斷劑組體積減少值小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組椎間盤質(zhì)量和體積變化比較(x±s)

注：與對照組比，*P<0.05，**P<0.01；與中藥+P38阻斷劑組比，※P<0.05，※※P<0.01。與1周末相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 椎間盤HE染色 (1)對照組：纖維環(huán)細胞排列紊亂，髓核細胞減少、體積縮小，膠原纖維組織甚至消失，部分細胞間質(zhì)消失，形狀不規(guī)則。(2)中藥組：髓核細胞減少，細胞核聚集，體積縮?。徊糠旨毎g質(zhì)消失，形狀不規(guī)則，呈膠凍樣改變，部分可見有血管組織浸潤。(3)P38阻斷劑組：髓核位于中心，髓核細胞散在排列，周圍是網(wǎng)狀膠原纖維；大量膠原纖維細胞呈長梭形，細胞核深染，長柱狀。(4)中藥+P38阻斷劑組：髓核細胞散在排列，膠原纖維呈網(wǎng)狀排列在髓核區(qū)周圍，纖維環(huán)細胞為長梭形，纖維環(huán)區(qū)圍繞在髓核區(qū)外周。見圖1。

2.3 Real Time PCR檢測椎間盤髓核細胞TNF-α、IL-1β、VEGF、MMP-3、MMP-9及P38MAPK的mRNA表達 (1)對照組：在1周末和4周末VEGF、TNF-α、IL-1β、MMP-3、MMP-9、P38MAPK、P-p38MAPK的蛋白均有一定程度表達；均低于中藥組，高于P38阻斷劑組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)中藥組：在1和4周末，TNF-α、IL-1β、VEGF、P38MAPK、MMP-3、MMP-9的mRNA表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；4周末，TNF-α、VEGF、MMP-3的mRNA表達均高于1周末，而MMP-9的mRNA表達低于1周末，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；4周末，IL-1β、P38MAPK的mRNA表達低于1周末，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(3)P38阻斷劑組：TNF-α、P38MAPK、MMP-3，在1周末的mRNA表達均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；4周末，TNF-α、VEGF、P38MAPK、MMP-3、MMP-9的mRNA表達均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；4周末，TNF-α、VEGF、MMP-3的mRNA表達低于1周末，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(4)中藥+P38阻斷劑組：1周末，除TNF-α的mRNA表達明顯低于對照組外，余指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；4周末，TNF-α、IL-1β、VEGF、P38MAPK、MMP-9的mRNA表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。

中藥組4周 P38阻斷劑組4周

圖1中藥組、P38阻斷劑組4周椎間盤HE染色

2.4 Western Blot檢測TNF-α、IL-1β、VEGF、MMP-3、MMP-9、P-p38MAPK、P38MAPK的蛋白表達 見圖2。(1)對照組：VEGF、TNF-α、IL-1β、MMP-3、MMP-9及P38MAPK、P-p38MAPK的蛋白均有一定程度的表達；1周末和4周末均低于中藥組，而高于P38阻斷劑組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)中藥組：在1周末，MMP-3、MMP-9、TNF-α、IL-1β及P-p38MAPK的蛋白表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 4周末，VEGF、MMP-3、MMP-9、TNF-α、P38MAPK、P-p38MAPK的蛋白表達明顯高于對照組和中藥+P38阻斷劑組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(3)P38阻斷劑組：在1周末，VEGF、MMP-3、MMP-9、P38MAPK及P-p38MAPK的蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)；4周末，TNF-α、P38MAPK、P-p38MAPK的蛋白表達明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(4)中藥+P38阻斷劑組：在1周末，TNF-α、IL-1β、VEGF、MMP-3、MMP-9、P-p38MAPK、P38MAPK的蛋白表達均低于中藥組(P<0.05)；4周末，TNF-α、VEGF、MMP-3、MMP-9、P-p38MAPK、P38MAPK的蛋白表達均低于中藥組(P<0.05，P<0.01)。

圖2 不同時段各組TNF-α、IL-1β、P38MAPK、P-p38MAPK、VEGF、MMP-3、MMP-9 的蛋白表達

3 討論

3.1 P38MAPK信號通路 Brewster等[1]首先提出P38MAPK的概念，“T-G-Y”三肽序列是其基本結(jié)構(gòu)“G”代表甘氨酸殘基，“T”代表蘇氨酸，“Y”代表酪氨酸?！癟”和“Y”雙位點的同時磷酸化才能激活MAPKs通路[2-3]。P38MAPK在椎間盤退變中起到炎癥介質(zhì)聚集作用，可以調(diào)控多種細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，介導中性粒細胞的活化，炎癥因子與P38MAPK通路的激活可相互形成正反饋，其中細胞因子IL-1β可釋放細胞外刺激信號對P38MAPK信號通路進行激活，并能夠促進椎間盤蛋白多糖降解并抑制其合成，參與椎間盤炎癥反應[3-4]。Rebecca等[5]認為致炎因子的表達可能受P38MAPK信號傳導通路的調(diào)控，而P38MAPK的磷酸化是人椎間盤退變的重要機制之一。P38MAPK信號傳導通路可以通過調(diào)控VEGF的表達參與椎間盤的退變。P38MAPK信號通路可被多種物理和化學因素、炎性因子或應激刺激激活，進而調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的基因表達活性，VEGF可加速趨化因子募集炎性細胞向椎間盤突出部位聚集發(fā)生吞噬；又能直接刺激血管內(nèi)皮細胞的分裂增殖，有利于重吸收[6-7]。有學者認為P38MAPK阻斷劑可抑制P38MAPK的磷酸化，緩解椎間盤的退變進程[8]。

3.2 益氣活血方與重吸收 腰椎間盤突出癥屬中醫(yī)“痹證”范疇。本方以《醫(yī)林改錯》補陽還五湯、《金匱要略》防己黃芪湯為基礎，加減化裁成“益氣活血方”以達益氣行血、化淤除濕、通經(jīng)活絡之功?！胺兰狐S芪湯”主補正氣，祛水濕；現(xiàn)代藥理研究表明防己黃芪湯有利于緩解神經(jīng)根水腫，減輕下肢放射癥狀[9]?！把a陽還五湯”補氣、活血、通絡，減輕缺血再灌注損傷[10]，利于恢復神經(jīng)功能[11]。方中生炙黃芪為君，炙黃芪補氣行血；生黃芪走表利水；黃芪多糖可提高機體的免疫功能以扶正[12]。防己祛風除濕、利水消腫；當歸補血活血，祛淤不傷正。白芥子長于溫化寒痰，與防己、當歸共為臣藥；三者均具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，其中防己對全身各部位急、慢性炎癥均可起到抑制作用[13-15]。川芎行氣活血止痛，助當歸活血祛淤，還具有鎮(zhèn)痛、神經(jīng)系統(tǒng)保護作用[16]。白術(shù)健脾除濕，木瓜祛濕通絡，且酸能軟堅散結(jié)，同助黃芪利水；木瓜、白術(shù)均具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用[17-18]，威靈仙通絡止痛、消骨鯁；也可鎮(zhèn)痛抗炎、利尿消腫[19]。本方注重利水濕，用炒白術(shù)以增其燥濕健脾之功，與防己合用增強利水消腫之功。威靈仙消骨鯁，對突出的髓核也具有一定消融作用。水蛭、地龍善散結(jié)通絡，共為佐藥。綜合全方，正氣盛，水濕除，淤血消，在一定程度達到重吸收的目的[20]。

3.3 益氣活血方與P38MAPK信號通路 突出椎間盤自然吸收主要與突出組織的新生血管、炎性細胞的吞噬、誘發(fā)自身免疫反應，基質(zhì)的合成和降解失衡等密切相關[21]。通過現(xiàn)有研究得知P38MAPK信號通路參與新生血管的形成、炎性反應的激活等過程當中，本實驗中中藥組結(jié)果明顯優(yōu)于對照組、P38MAPK阻斷劑組，說明益氣活血方可激活P38MAPK信號通路，促進突出組織重吸收的作用。

重吸收發(fā)生的機制學說眾多，本實驗只是從一方面進行研究，闡述了其存在的可能性，但本實驗存在諸多不足之處，希望通過后續(xù)研究，對突出椎間盤重吸收的機制能有更清楚的認識。