文麗梅，盧帥，呂國棟，李亞芬，鄭璇，田春艷，趙軍，王建華

氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)，最早是在1985年由Park等[1]提出。正常情況下，機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但是在遭受到有害刺激時，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量生成，超過了機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的清除能力，致使ROS的產(chǎn)生與清除失衡，就會導(dǎo)致氧化應(yīng)激[2]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病[3]、糖尿病、高血壓或其他心血管疾病[4-5]、癌癥等許多疾病都與氧化應(yīng)激有關(guān)。過氧化氫(H2O2)是一種很強的氧化劑，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成機(jī)體氧化損傷。ROS的大量積聚廣泛攻擊體內(nèi)生物大分子，被攻擊的蛋白質(zhì)、脂類可經(jīng)降解，再重新合成，但核酸分子損傷后一般不被降解而直接修復(fù)，未被修復(fù)的損傷DNA片段可積累下來，造成進(jìn)一步更大的損害。有報道稱幾乎所有氧化應(yīng)激狀態(tài)都有H2O2產(chǎn)生，它還能夠穿透細(xì)胞膜，而且易于取得，性質(zhì)穩(wěn)定[6]。因此，H2O2已成為建立體外氧化損傷模型的重要工具[7-8]。本研究以H2O2為誘導(dǎo)劑，以人肝癌細(xì)胞BEL7402為基礎(chǔ)，通過測定細(xì)胞存活率、ROS含量、DNA損傷狀況、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，探索得到最佳H2O2濃度及干預(yù)時間，從而構(gòu)建體外氧化應(yīng)激模型，為進(jìn)一步研究抗肝癌藥物的氧化應(yīng)激機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本研究起止時間為2017年3月至11月。

1.1試劑與材料BEL7402購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)；噻唑藍(lán)(MTT，美國Biosharp公司，生產(chǎn)批號2016/12)；碘化丙啶(生物染色劑級，純度≥95%，生產(chǎn)批號P-4170)和瓊脂糖(生物技術(shù)級，純度≥98%，生產(chǎn)批號9012-36-6)均購自美國Sigma公司；胰蛋白酶(生產(chǎn)批號1665788)、胎牛血清(FBS，生產(chǎn)批號1205331)和RPMI 1640培養(yǎng)基(生產(chǎn)批號8116524)均購自美國Gibco公司；青鏈霉素(雙抗，美國Hyclone公司，生產(chǎn)批號J160035)；二甲基亞砜(DMSO，生產(chǎn)批號#2035C358)、低熔點瓊脂糖(生物技術(shù)級，生產(chǎn)批號0815)和乙二胺四乙酸(EDTA，分析純，生產(chǎn)批號6381-92-6)均購自美國Amresco公司；H2O2(醫(yī)用級別，陜西欣通化工公司，生產(chǎn)批號20160526)；PBS緩沖液(北京索萊寶公司，生產(chǎn)批號20160829)；丙二醛試劑盒(MDA，生產(chǎn)批號20160707)、超氧化物歧化酶試劑盒(SOD，生產(chǎn)批號20160707)和谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(GSH-Px，生產(chǎn)批號20160708)均購自南京建成生物工程研究所；測定與分析用水均為超純水。

1.2儀器SW-CJ-IFD型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器(日本SANYO公司)；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；IX73熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；SORVALL LEGEND RT+冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)；37 ℃恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Varioskan Flash全波長掃描式多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；Mupid-2plus電泳儀(日本MUPID公司)；PSY-2220數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1BEL7402培養(yǎng)[9]將BEL7402細(xì)胞培養(yǎng)于CO2恒溫(37 ℃)飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清，2%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，每2～3 d換培養(yǎng)液，消化采用0.25%的胰蛋白酶(含0.02%的EDTA)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2分組及處理 實驗共設(shè)4組，分別為健康對照組、10 μmol/L H2O2組、100 μmol/L H2O2組和1 000 μmol/L H2O2組，每組做3個平行副孔。

1.3.3細(xì)胞存活率測定 用MTT法檢測細(xì)胞存活率[10]，取對數(shù)生長期的BEL7402細(xì)胞，按105個/mL接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄去上清，健康對照組加200 μL培養(yǎng)基，H2O2處理組分別加等體積的終濃度為10、100和1 000 μmol/L的H2O2的培養(yǎng)基溶液，每組做3個平行副孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12和24 h，每孔再加入0.01 mL 5 mg/mL的MTT，繼續(xù)孵育4 h后，吸去上清液，每孔加0.2 mL的DMSO，震蕩5 min，用酶標(biāo)儀對各孔在波長570 nm處吸光度值進(jìn)行檢測。

1.3.4細(xì)胞DNA損傷測定[11]采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)來檢測細(xì)胞DNA的損傷情況(彗星實驗)，取對數(shù)生長期的BEL7402細(xì)胞，按105個/mL接種于96孔板上，設(shè)為4組，每組3個平行副孔。培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，采用上述加藥物方法處理4 h，吸去培養(yǎng)液，用4℃預(yù)冷的PBS洗1次，加入0.25 %胰蛋白酶進(jìn)行消化后，離心機(jī)1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，再用PBS重懸。將載玻片浸入0.6 %的正常熔點瓊脂糖中，對載玻片進(jìn)行干烤過夜(65 ℃)，待用。取0.1 mL單細(xì)胞懸浮液，離心，沉淀用100 μL 0.75 %的低密度瓊脂糖混勻，鋪于第一層膠上，蓋上蓋玻片，4 ℃放置5 min，使其凝固后移去蓋玻片。將膠板浸入4 ℃新配置的細(xì)胞裂解液(0.1 mol/L Na2EDTA、2.5 mol/L NaCl、0.01 mol/L三羥甲基氨基甲烷 (trihydroxymethyl aminomethane，Tris)，NaOH調(diào)pH至10.0，臨用前根據(jù)用量按總體積加1 % Triton-X-100，10 % DMSO混勻)中1.5 h，溶解細(xì)胞膜和核膜。取出載玻片，用PBS輕柔沖洗2次，以去掉載玻片表面高濃度的鹽，然后將膠板浸入4 ℃水平電泳槽(堿性電泳緩沖液為：0.001 mol/L Na2EDTA、0.3 mol/L NaOH，pH 13.0，現(xiàn)配現(xiàn)用)中，緩沖液約覆過膠面0.25 cm。堿解旋20 min，電泳(20 V，200 mA)20 min。電泳完畢后，濾紙吸干載玻片電泳緩沖液，再用Tris-HCl(pH 7.5)中和15 min。最后用50 μg/mL的PI染液避光染色15 min，蒸餾水脫色5 min，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察[12]并拍照。用CASP軟件對圖片中采用等距隨機(jī)抽樣法選取的20個細(xì)胞進(jìn)行尾距(olive tail moment，OTM)的測定(尾部DNA的百分比與頭、尾中心間距的乘積)。

1.3.5活性氧含量測定[13]雙氫羅丹明123(DHR123)作為一種熒光探針本身無熒光，但能夠進(jìn)入大多數(shù)細(xì)胞，被氧化成的熒光產(chǎn)物羅丹明123大量聚集在線粒體膜上，即被廣泛用來檢測活性氧自由基含量的變化。實驗分為4組，即正常組、10、100、1 000 μmol/L H2O2藥物處理組。先向長滿細(xì)胞的孔板中加入終濃度為2×10-6mol/L的DHR123，放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，采用全波長掃描式多功能酶標(biāo)儀讀數(shù)，動態(tài)讀取熒光值120 min，每10分鐘1次。

1.3.6MDA、SOD、GSH-Px測定 采用上述加藥物方法處理BEL7402細(xì)胞4 h后，用無菌PBS洗3遍，用0.25 %的胰蛋白酶(含0.02 %的EDTA)消化，制成細(xì)胞懸浮液，4 000 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞，用1 mLPBS洗1遍，然后加細(xì)胞裂解液(150 mmol/L NaCl、150 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、1 % Triton X-100，pH 8.0)裂解細(xì)胞，低溫(4 ℃)離心1 h，收集上清液，參照南京建成生物工程研究所提供的相應(yīng)試劑盒說明書，檢測細(xì)胞內(nèi)MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

2 結(jié)果

2.1不同濃度H2O2處理對BEL7402存活率影響不同濃度的H2O2處理BEL7402細(xì)胞0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h后，對其存活率進(jìn)行檢測，統(tǒng)計結(jié)果(χ2=52.94，P<0.01)如圖1所示：高濃度的H2O2(1 000 μmol/L)抑制BEL7402細(xì)胞存活率，而低濃度的H2O2(10和100 μmol/L)則是先抑制增長后刺激增長。100 μmol/L H2O2處理BEL7402細(xì)胞4 h后，其存活率為(43.44±5.74)%，與10 μmol/L處理組(92.77±5.51)%相比，細(xì)胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 不同濃度H2O2對BEL7402細(xì)胞活性的影響(n=3)

2.2不同濃度H2O2處理對BEL7402細(xì)胞ROS含量的影響采用不同濃度的H2O2處理BEL7402 細(xì)胞120 min內(nèi)活性氧含量如圖2所示：100 μmol/L H2O2組BEL7402細(xì)胞體內(nèi)的活性氧含量在40 min時達(dá)到峰值，之后呈下降趨勢；而10 μmol/L H2O2組BEL7402體內(nèi)的活性氧含量始終處于較低水平；1 000 μmol/L H2O2組BEL7402體內(nèi)的活性氧含量在40 min之后低于正常組，這可能與BEL7402細(xì)胞不能耐受1 000 μmol/L H2O2，細(xì)胞存活率下降，從而導(dǎo)致活性氧含量急劇下降，以致低于健康對照組。

圖2 不同濃度H2O2對BEL7402細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響(n=3)

2.3不同濃度H2O2處理對BEL7402細(xì)胞DNA損傷影響不同濃度H2O2處理BEL7402細(xì)胞4 h后單細(xì)胞凝膠電泳實驗見圖3。各組Olive尾距(OTM值)統(tǒng)計結(jié)果(F=16.25，P<0.01)見表1。與健康對照組比較，10 μmol/L H2O2組OTM值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，100 μmol/L H2O2組OTM值升高(P<0.05)，1 000 μmol/L H2O2組OTM值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 彗星實驗檢測H2O2誘導(dǎo)的BEL7402細(xì)胞DNA損傷：A為健康對照組；B為10 μmol/L H2O2組；C為100 μmol/L H2O2組；D為1 000 μmol/L H2O2組

組別細(xì)胞數(shù)尾距/(μm,x±s)健康對照組200.12±0.2210 μmol/L H2O2組200.23±0.15100 μmol/L H2O2組207.04±2.84a1 000 μmol/L H2O2組2016.57±5.21b

注：與健康對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

2.4不同濃度H2O2處理對BEL7402細(xì)胞MDA含量、SOD、GSH-Px活性影響濃度不同的H2O2作用于BEL7402細(xì)胞4 h后MDA含量(F=441.92，P<0.01)、SOD活性(F=713.99，P<0.01)及GSH-Px活性(F=46.578，P<0.01)結(jié)果如表2所示：與健康對照組相比，10 μmol/L的H2O2作用于細(xì)胞，MDA含量升高(P<0.05)；100 μmol/L H2O2處理細(xì)胞后，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性下降(P<0.05或P<0.01)；1 000 μmol/L H2O2處理細(xì)胞后，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 不同濃度H2O2處理(平行副孔數(shù)=5)對BEL7402

注：與健康對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

3 討論

在人體中，肝臟是進(jìn)行代謝的主要臟器，也是外源性毒物和藥物等代謝的主要器官，因此也是體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激的中心部位。肝癌是惡性腫瘤中發(fā)病率較高的一種，嚴(yán)重威脅著人民的生命健康。目前有研究表明[14]，一方面氧化應(yīng)激或脂質(zhì)過氧化造成的DNA氧化損傷是腫瘤發(fā)生的重要致病機(jī)理，另一方面腫瘤細(xì)胞對氧化應(yīng)激的敏感性高于正常細(xì)胞。1974年，從臨床肝癌手術(shù)標(biāo)本中成功提取培養(yǎng)的BEL7402細(xì)胞株，與臨床肝癌細(xì)胞相似。Roshan[15]指出吉馬酮可以濃度依賴性的提高活性氧濃度并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，通過MDA含量反映脂質(zhì)過氧化程度，SOD、GSH是機(jī)體主要抗氧化酶，二者水平是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[16]。因此本研究對于研究氧化應(yīng)激類的肝病，如肝癌、脂肪肝、各種因素導(dǎo)致的肝炎等的發(fā)病機(jī)理、藥物的臨床應(yīng)用都有重要的意義。

H2O2易得，性質(zhì)穩(wěn)定，易透過細(xì)胞膜，生成活性氧自由基，用H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型，應(yīng)用最為廣泛[17]。同時，也是細(xì)胞內(nèi)最豐富的活性氧簇ROS之一，參與調(diào)節(jié)新陳代謝、凋亡和生長因子等相關(guān)的信號通路。盡管其本身會迅速與信號分子反應(yīng)而失活，但其造成級聯(lián)反應(yīng)能導(dǎo)致氧化應(yīng)激持續(xù)存在，使其成為氧化應(yīng)激研究的重要工具藥。但是，H2O2的最終濃度及處理時間所造成的腫瘤細(xì)胞BEL7402的氧化應(yīng)激狀態(tài)仍不明確，其具體機(jī)制仍有待闡明，因此，探討H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中，動態(tài)監(jiān)測BEL7402細(xì)胞系的應(yīng)激反應(yīng)必將對研究氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制和預(yù)防提供新的思路。

不同濃度的H2O2對細(xì)胞存在雙向性作用：在H2O2濃度作用不同時間后發(fā)現(xiàn)高濃度H2O2(1 000 μmol/L)抑制BEL7402細(xì)胞存活率，而低濃度的H2O2(10和100 μmol/L)則是先抑制增長后刺激增長。因此可以說明在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，由于細(xì)胞對H2O2的削減作用不同，可能影響實驗結(jié)果。肝癌細(xì)胞在氧化應(yīng)激環(huán)境中存在雙向反應(yīng)。另外，我們采用4 h的藥物處理時間，濃度為100 μmol/L的H2O2作用于BEL7402細(xì)胞，彗星實驗效果明顯，其細(xì)胞尾部明顯增長，而且SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，變化明顯。推測4 h為最佳作用時間，而100 μmol/L為最佳H2O2濃度。除此之外，100 μmol/L H2O2可使BEL7402細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量在40 min時升到峰值，且在藥物處理的120 min內(nèi)，其ROS含量始終高于正常組的ROS含量，說明其既可升高BEL7402細(xì)胞內(nèi)的ROS含量，且使其保持存活狀態(tài)，模擬了體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，濃度為100 μmol/L的H2O2作用BEL7402細(xì)胞4 h，可成功構(gòu)建以H2O2為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑的BEL7402細(xì)胞體外氧化應(yīng)激模型。ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激是多種肝病的共同病理生理基礎(chǔ)。人肝癌細(xì)胞株BEL7402與肝細(xì)胞具有相似的生物學(xué)活性，因此BEL7402細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立為揭示氧化應(yīng)激機(jī)制以及研究和篩選可能通過氧化應(yīng)激機(jī)制發(fā)揮抗肝病作用的新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。