羅 頌，張 羽，何彥瑤，劉敏卓

(1.湖南省兒童醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)沙 410007；2.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙 410083)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是由多種病因引起的以肝臟細(xì)胞內(nèi)脂類(lèi)物質(zhì)異常積蓄為主要特征的臨床綜合征，其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。NAFLD與胰島素抵抗2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和高脂血癥等疾病密切相關(guān)[2]。近年來(lái)隨著人們生活水平的提高，NAFLD發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡逐年下降，兒童和青少年的脂肪肝發(fā)病率逐年上升。NAFLD已成為危害人類(lèi)健康最常見(jiàn)的慢性疾病之一[3]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥與NAFLD密切聯(lián)系，在NAFLD的患者和動(dòng)物模型肝臟組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)含量增加[4-5]。肝細(xì)胞炎癥因子的分泌增加可引起肝細(xì)胞微環(huán)境炎性反應(yīng)，而抗炎藥物可改善NAFLD患者的臨床癥狀[6]。

水飛薊賓是從植物水飛薊的種子和果實(shí)中提取得到的黃酮類(lèi)化合物，其具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基、維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性和促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用，臨床主治各種急慢性肝炎、初期肝硬化和肝中毒等疾病[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓能增加高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠胰島素敏感性，改善肝臟脂質(zhì)代謝[9]。有研究報(bào)道，水飛薊賓可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥小體NLRP3的組裝而抑制炎癥因子IL-1β的釋放[10]。水飛薊賓在高脂狀況下抑制肝臟炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制尚不清楚。

腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)是調(diào)控細(xì)胞能量平衡的關(guān)鍵因子，AMPK的活化對(duì)非酒精性脂肪肝具有顯著作用，能調(diào)節(jié)膽固醇代謝，改善血脂異常,還可抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子的合成[11]，水飛薊賓是否通過(guò)AMPK調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，目前還不清楚。本文通過(guò)自由脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞炎癥模型研究水飛薊賓對(duì)炎癥因子分泌減少的機(jī)制，為水飛薊賓防治肝臟疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 生物安全柜(美國(guó)Nuaire公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司)；倒置顯微鏡(德國(guó)卡爾蔡司公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；SDS-PAGE凝膠Western Blot儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。

1.2試藥 水飛薊賓(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、油酸(均為阿拉丁試劑有限公司)；棕櫚酸、油紅O染色試劑(美國(guó)Sigma公司)；TNF-α試劑盒，IL-1β試劑盒，Elisa試劑盒，AMPK抗體，β-actin抗體(博士德生物公司)；p-AMPK抗體(美國(guó)CST公司)；RIPA裂解液，BCA法蛋白定量試劑盒(碧云天生物公司)；HepG2細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；小牛血清(Gibco公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Real-time PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)。

2 方法

2.1HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) HepG2細(xì)胞用含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)，用質(zhì)量濃度為2.5 g·L-1的胰酶消化傳代。

2.2水飛薊賓對(duì)FFA誘導(dǎo)炎癥因子生成的影響 將HepG2細(xì)胞密度調(diào)整為2.5×104個(gè)·mL-1，接種于24孔板。待細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、FFA處理組(500 μmol·L-1，油酸∶棕櫚酸=2∶1)以及水飛薊賓組(水飛薊賓預(yù)孵育4 h后，加入500 μmol·L-1的FFA)。

2.3水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 將HepG2細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至60%時(shí)，用不同濃度的水飛薊賓(0，5，10，20，40，80和160 μmol·L-1)處理24 h，換液后加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)2～4 h后，棄上清液。每孔加入200 μL的DMSO，待藍(lán)色結(jié)晶溶解后，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4Elisa試劑盒法檢測(cè)上清液中炎癥因子的水平 用24孔板培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理各組細(xì)胞后，收集每組細(xì)胞的上清液，按照Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β的水平。

2.5基因表達(dá)分析 按照Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定總濃度后，將不同樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于Real-time PCR擴(kuò)增。TNF-α和IL-1β的引物序列為：TNF-α：5′-AGCTGGTGGTGCCATCAGAGG-3′(上游)，5′-TGGTAGGAGACGGCGATGCG-3′(下游)。IL-1β：5′-TGGCAATGAGGATGACTTGT-3′(上游)，5′-TGGTGGTCGGAGATTCGTA-3′(下游)，β-actin：5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′(上游)，5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′(下游)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)，4 ℃終止反應(yīng)。β-actin作為內(nèi)參，用2-△△Ct法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.6Western Blot 收集細(xì)胞后加入適量PIPA裂解液(含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑)進(jìn)行總蛋白提取，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白條帶移至PVDF膜上(250 mL，100 min)，用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加一抗AMPK和p-AMPK抗體4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌后孵二抗1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ECL(enhanced chemilumin escence)底物化學(xué)發(fā)光顯色后曝光，采圖。Amersham Image 600圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參。

2.7油紅O染色 細(xì)胞處理完畢后，用PBS緩沖液沖洗3次，用質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。用體積分?jǐn)?shù)為60%的異丙醇洗后晾干。加入適量體積分?jǐn)?shù)為0.3%的油紅O 溶液染色3 min。棄去油紅O溶液，用體積分?jǐn)?shù)為60%的異丙醇洗滌3次，顯微鏡下觀察并拍照。定量分析時(shí)加入異丙醇將油紅O溶解，在510 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。

3 結(jié)果

3.1水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 MTT法檢測(cè)不同濃度水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，5，10，20，40，80和160 μmol·L-1的水飛薊賓處理細(xì)胞24 h對(duì)細(xì)胞的活力無(wú)影響。見(jiàn)圖1。

3.2水飛薊賓降低FFA誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá) FFA可誘導(dǎo)肝細(xì)胞炎癥因子分泌的增加，結(jié)果顯示，500 μmol·L-1的FFA可增加HepG2細(xì)胞炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白的表達(dá)。用80和160 μmol·L-1的水飛薊賓預(yù)孵育細(xì)胞4 h后，F(xiàn)FA處理24 h，則降低IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

3.3水飛薊賓降低肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的生成 HepG2細(xì)胞在FFA處理24 h后，會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)生成。用油紅O染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)FA組能明顯增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)生成，而水飛薊賓80和160 μmol·L-1能降低細(xì)胞中脂質(zhì)的生成。見(jiàn)圖3。

圖1不同濃度水飛薊賓對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

Fig.1 Effect of different concentration silybin on the viability of HepG2 cells

圖2水飛薊賓對(duì)FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，與FFA組比較#P<0.05。

Fig.2 Effect of silybin on the expression of inflammatory factor of HepG2 cells induced by FFA

Note：*P<0.05，**P<0.01 vs control group，#P<0.05 vs FFA group.

圖3水飛薊賓對(duì)FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)生成的影響

注：與對(duì)照組比較***P<0.001，與FFA組比較##P<0.01。

Fig.3 Effect of silybin on the lipid accumulation in FFA-induced HepG2 cells

Note：***P<0.001 vs control group，##P<0.01 vs FFA group.

3.4水飛薊賓通過(guò)AMPK調(diào)控HepG2炎癥因子的生成 為了探討水飛薊賓是否通過(guò)AMPK調(diào)控炎癥因子的生成，用免疫印跡法檢測(cè)AMPK的變化。結(jié)果顯示，F(xiàn)FA對(duì)HepG2細(xì)胞中AMPK的表達(dá)無(wú)顯著影響，但能顯著降低AMPK的磷酸化水平。水飛薊賓(80 和160 μmol·L-1)可增加p-AMPK的表達(dá)。用AMPK抑制劑(compound C)或水飛薊賓(80 μmol·L-1)預(yù)孵育HepG2細(xì)胞，用FFA處理，結(jié)果顯示，AMPK抑制劑可阻止水飛薊賓對(duì)炎癥因子的生成。見(jiàn)圖4。

圖4Silybin通過(guò)AMPK調(diào)節(jié)HepG2炎癥因子的生成

注：與對(duì)照組比較*P<0.05；與FFA組比較#P<0.05。

Fig.4 Silybin regulating inflammatory factors through AMPK in HepG2 cells

Note：*P<0.05 vs control group，#P<0.05 vs FFA group.

4 討論

隨著全球城市化進(jìn)程的加快和生活方式的改變，NAFLD的發(fā)病率日益增長(zhǎng)，已成為危害人類(lèi)健康的重要疾病之一[3]。目前，在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中，“二次打擊”學(xué)說(shuō)被普遍接受。第一次打擊是指胰島素引起的脂肪變性，在此基礎(chǔ)上炎癥因子、游離脂肪酸和氧化應(yīng)激等因素第二次打擊肝細(xì)胞，產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致肝臟病理性變化[12]。由于炎癥因子在胰島素抵抗中發(fā)揮了重要作用，因此，炎癥反應(yīng)貫穿于NAFLD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中[13]。水飛薊賓具有保肝、護(hù)肝的作用，可通過(guò)清除體內(nèi)活性氧、抗脂質(zhì)過(guò)氧化和抑制一氧化氮的產(chǎn)生來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞受損[14]。研究結(jié)果顯示，80和160 μmol·L-1的水飛薊賓可抑制FFA誘導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生。

在NAFLD和胰島素抵抗時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)FFA濃度升高，過(guò)量的自由脂肪酸發(fā)生異位存儲(chǔ)，產(chǎn)生脂毒性[15]。FFA可引起線粒體功能障礙，引起氧化應(yīng)激和活性氧增加，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路[16-17]。結(jié)果表明，F(xiàn)FA能誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-1β和TNF-α。AMPK在肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，活化的AMPK可通過(guò)調(diào)節(jié)與脂肪代謝相關(guān)的靶蛋白活性從而影響肝臟脂質(zhì)代謝。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB活性抑制肝臟炎癥反應(yīng)，減輕肝損傷，說(shuō)明AMPK參與了NAFLD的病理過(guò)程，其可能是防治NAFLD的靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓逆轉(zhuǎn)FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞AMPK磷酸化的降低，對(duì)AMPK的蛋白量沒(méi)有影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AMPK抑制劑compound C能阻止水飛薊賓對(duì)炎癥因子的抑制作用。這些研究均表明，水飛薊賓是通過(guò)AMPK來(lái)發(fā)揮作用的。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可通過(guò)AMPK抑制肝細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，本研究對(duì)于闡述水飛薊賓防治NAFLD的機(jī)制具有重要意義。