戴 爽，覃虹錕，王鑫怡，宗 莉*，王亞菁*

(1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，南京 211198；2.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院生理學(xué)教研室，南京 211198；3.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，南京 211198)

黑色素瘤是一種惡性皮膚癌，其發(fā)病率占皮膚癌的5%，致死率卻高達(dá)皮膚癌相關(guān)死亡的75%[1]。早期黑色素瘤主要通過手術(shù)切除進(jìn)行治療，但晚期和已轉(zhuǎn)移的黑色素瘤極難治療，死亡率極高，晚期黑色素瘤病人5年生存率低于20%[2]。轉(zhuǎn)移瘤的治療主要包括化學(xué)治療[3]、放射治療[4]、靶向治療[5]和免疫治療[6]。其中免疫治療近年來成為黑色素瘤治療的研究熱點(diǎn)之一，而與納米遞送系統(tǒng)聯(lián)用更是有望解決黑色素瘤免疫治療的現(xiàn)存問題。本文就基于納米遞送系統(tǒng)的黑色素瘤免疫治療研究現(xiàn)狀進(jìn)行簡要綜述。

1 黑色素瘤免疫治療現(xiàn)狀

黑色素瘤是最具有免疫原性的腫瘤之一，易于逃脫免疫監(jiān)控、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。免疫治療已被應(yīng)用于黑色素瘤的治療[7]，主要包括細(xì)胞因子治療[8]、免疫檢查點(diǎn)阻斷免疫治療[9]、過繼性免疫治療[10]和嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療[11]等。

免疫檢查點(diǎn)抑制劑獲批之前，美國FDA批準(zhǔn)采用化療(氮烯唑胺)、羥基脲或免疫治療(高劑量IL-2)作為晚期黑色素瘤的治療方案[1，12-13]。這些方案首次給藥有效率較高，能顯著提高總體生存率，但一般6～9個(gè)月后就會(huì)復(fù)發(fā)[14]。IL-2可延長緩解期，但其半衰期短，需要多次大劑量注射，具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)[15]。2011年，美國FDA批準(zhǔn)了首個(gè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑ipilimumab(CTLA-4抑制劑)，用于治療晚期黑色素瘤，此后免疫檢查點(diǎn)抑制劑成為公認(rèn)的晚期黑色素瘤免疫治療有效策略，顯著推進(jìn)了晚期黑色素瘤免疫治療的發(fā)展。但免疫檢查點(diǎn)抑制劑僅對(duì)很小一部分病人有效，大部分病人對(duì)此類抑制劑沒有免疫響應(yīng)。

2 納米遞送系統(tǒng)的應(yīng)用

納米遞送系統(tǒng)，即納米尺寸(1～100 nm)的藥物遞送系統(tǒng)，包括無機(jī)材料、有機(jī)材料和細(xì)胞仿生型等載體系統(tǒng)，具有降低給藥劑量、延長抗原呈現(xiàn)時(shí)間、增加穩(wěn)定性和誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，有望用于晚期黑色素瘤的治療[16-18]。

2.1無機(jī)納米載體 無機(jī)納米載體主要是指無機(jī)材料(如金[19]、鐵[20]、石墨烯[21]和介孔硅[22]等)構(gòu)建的納米載體，具有粒徑小、尺寸可調(diào)、比表面積大、易修飾、穩(wěn)定性好和理化性質(zhì)特殊等優(yōu)點(diǎn)。

無機(jī)納米載體應(yīng)用于黑色素瘤免疫治療，可增強(qiáng)誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮作用。納米技術(shù)為免疫治療提供了新的遞送策略，但要實(shí)現(xiàn)高效激活T細(xì)胞仍待進(jìn)一步完善。Steenblock E R等[23]報(bào)道，納米粒誘導(dǎo)產(chǎn)生的短期免疫反應(yīng)遠(yuǎn)不如微粒。Perica K等[24]基于生物相容性氧化鐵納米粒(50～100 nm)或生物素包裹的量子點(diǎn)納米晶(約30 nm)2種納米制劑，構(gòu)建了人造抗原呈遞細(xì)胞(APCs)納米遞送系統(tǒng)。體外實(shí)驗(yàn)表明，構(gòu)建的2種載體都能誘導(dǎo)小鼠脾臟細(xì)胞和人外周血T細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞增殖。選用接種黑色素瘤細(xì)胞B16的裸鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，能有效預(yù)刺激特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，減緩腫瘤生長，且效果優(yōu)于對(duì)照的人造APCs微米遞送系統(tǒng)。

此外，無機(jī)納米粒因其獨(dú)特的光、電、磁性質(zhì)，在顯影成像方面具有一定優(yōu)勢(shì)。常用的細(xì)胞追蹤方法是通過報(bào)告基因標(biāo)記細(xì)胞，該標(biāo)記方法持續(xù)時(shí)間較長，存在組織透光性差、無法定量等問題[25]。Meir R等[26]人工改造T細(xì)胞使其可以表達(dá)黑色素瘤特異性T細(xì)胞受體，并標(biāo)記上葡萄糖修飾的金納米粒(約20 nm)作為計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)造影劑，將該T細(xì)胞靜脈注射進(jìn)入移植了人黑色素瘤的小鼠體內(nèi)，可以追蹤檢測(cè)T細(xì)胞在體內(nèi)的分布、遷移和動(dòng)力學(xué)。金納米粒不影響人工T細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的分布和功能，且能穩(wěn)定標(biāo)記在T細(xì)胞上，用于T細(xì)胞的CT追蹤。Chen F等[22]采用Cy5熒光二氧化硅納米粒，與黑皮素受體1(MC1-R)靶向的α黑色素細(xì)胞刺激素(αMSH)肽結(jié)合，用于黑色素瘤特異性顯影。MC1-R是靶向黑色素瘤特異性標(biāo)志物的一種多肽，但由于腎攝取過多影響了其在臨床效果和治療中的應(yīng)用，該二氧化硅納米粒能有效解決這一問題。通過表面修飾優(yōu)化的αMSH肽，納米粒與MC1-R的親和力能提高10倍。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，該二氧化硅納米粒在黑色素瘤小鼠模型中能有效靶向腫瘤，示蹤顯示其易通過受體介導(dǎo)的方式被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞。該納米遞送系統(tǒng)較好地克服了現(xiàn)有臨床黑色素瘤抗體類探針的耐藥和脫靶毒性等缺點(diǎn)，有望用于黑色素瘤特異性顯影和治療。

2.2有機(jī)納米載體 有機(jī)納米載體一般指以天然或合成有機(jī)高分子材料制備的納米粒。天然高分子材料包括殼聚糖[27]、海藻酸鈉[28]、透明質(zhì)酸[29]和當(dāng)歸多糖[30]等，合成高分子材料包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)[31]、聚乙烯亞胺(PEI)[32]和聚酰胺-胺(PAMAM)樹狀大分子聚合物[33]等。有機(jī)高分子材料一般具有毒性低和生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)。有機(jī)納米遞送系統(tǒng)既能通過載體修飾提高遞送效率和抗原呈遞效率，又能保護(hù)免疫疫苗不被降解，高效低毒地將藥物遞送至特定部位。

有機(jī)納米載體能夠降低劑量，減小毒性，尤其是對(duì)于半衰期較短、劑量較大的藥物。IL-2具有抗腫瘤活性，但重組IL-2蛋白在血清中半衰期短，需要重復(fù)大劑量注射才能起到效果，因而具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)[34]。Yao H等[35]在低相對(duì)分子質(zhì)量聚乙烯亞胺(600 Da)上連接β環(huán)糊精，再修飾上葉酸，將制備得到的高分子材料和IL-2質(zhì)?；旌现苽涑杉s100 nm的復(fù)合物。癌旁注射該復(fù)合物能有效抑制腫瘤生長，延長B16-F1黑色素瘤移植C57BL/6小鼠的生存期。此外，該復(fù)合物能刺激外周血中CD8+，CD4+ T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的激活和增殖，并增加其向腫瘤環(huán)境中的滲透。Park J等[36]采用脂質(zhì)聚合物凝膠遞送高劑量IL-2至免疫抑制的腫瘤微環(huán)境中，結(jié)果表明，該納米制劑能有效提高生存率和自然殺傷細(xì)胞活性，延緩黑色素瘤生長。

有機(jī)納米載體能夠?qū)目乖f送給APCs，保護(hù)抗原肽等不被酶解，提高穩(wěn)定性。黑色素瘤免疫治療中常涉及抗原肽的遞送問題。有機(jī)高分子材料，如PLGA，形成的納米粒能有效保護(hù)抗原肽。有報(bào)道應(yīng)用PLGA納米粒用于遞送小鼠黑色素瘤抗原多肽重組人gp100(hgp100)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP2)。當(dāng)注射進(jìn)黑色素瘤小鼠后，與多肽和弗氏佐劑的混合制劑相比，這些載多肽的PLGA納米粒被樹突狀細(xì)胞(DCs)攝取更多，且誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)更加強(qiáng)烈[17]。通過表面修飾DCs特異性或陽性的受體/生物標(biāo)志物，可顯著提高納米粒遞送到DCs的效率，促進(jìn)攝取和內(nèi)化，增強(qiáng)抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞的能力[16，37]。

此外，載抗原納米粒有助于抗原被DCs攝取，避免疫苗制劑導(dǎo)致的過度炎癥反應(yīng)(如鋁鹽，弗氏佐劑)。另外，鑒于可溶性蛋白或多肽是通過胞飲被APCs攝取，體內(nèi)極少呈現(xiàn)為膜上的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)配體，聚合物納米粒包裹的抗原通過吞噬作用被內(nèi)化，能更有效的通過MHCⅠ類途徑被交叉呈遞給CD8+細(xì)胞[38]。因此，聚合物納米粒介導(dǎo)的抗原遞送系統(tǒng)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫。

2.3細(xì)胞-納米仿生型載體 近期，細(xì)胞或細(xì)胞膜載體被用于藥物遞送，包括紅細(xì)胞[39]、巨噬細(xì)胞[40]、自然殺傷細(xì)胞[41]和干細(xì)胞[42]等。與外源性遞送系統(tǒng)相比，細(xì)胞載體屬于內(nèi)源性載體，免疫原性低，且具有長循環(huán)、自主靶向等優(yōu)點(diǎn)，在黑色素瘤免疫治療中有一定的優(yōu)勢(shì)[43]。

免疫細(xì)胞等循環(huán)細(xì)胞近年來成為新型遞送載體，具有長循環(huán)等特點(diǎn)，有些免疫細(xì)胞還具有腫瘤趨向性。Xie Z等[44]選用人外周血的單核細(xì)胞(THP-1)，攝取包裹維羅非尼(Vemurafenib)的聚合物納米粒進(jìn)入胞內(nèi)，形成單核/巨噬細(xì)胞遞送系統(tǒng)，以靶向治療黑色素瘤。THP-1作為單核細(xì)胞模型，與腫瘤細(xì)胞和炎癥細(xì)胞之間的親和力高。利用THP-1作為免疫細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞的能力，內(nèi)吞可降解納米粒，通過細(xì)胞內(nèi)載藥，實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性藥物遞送。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于THP-1的納米粒遞送系統(tǒng)能有效發(fā)揮維羅非尼對(duì)1205Lu和WM35 2種黑色素瘤細(xì)胞的殺傷作用。這種遞送系統(tǒng)不僅有望用于其他免疫治療藥物的遞送，也有望用于其他涉及固有免疫反應(yīng)的疾病。

抗原呈遞給APCs是啟動(dòng)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟，一些天然的微生物處于微米級(jí)尺寸，易被APCs識(shí)別，發(fā)揮疫苗佐劑的作用，如釀酒酵母S.cerevisiae可靶向遞送抗原至APCs，且無病原性，能起到免疫佐劑的作用[45]。Liu D Q等[46]采用重組釀酒酵母作為疫苗載體，該重組釀酒酵母的細(xì)胞壁上能表達(dá)黑色素瘤相關(guān)抗原Trp2，并通過靜電作用在酵母細(xì)胞壁上修飾包裹了吲哚2,3-雙加氧酶(IDO)siRNA的PEI納米粒，以克服免疫抑制。該細(xì)胞遞送系統(tǒng)遞送的特異性siRNA能被APCs有效攝取，產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)和siRNA的用量和毒性。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，該酵母細(xì)胞遞送載體能有效抑制DCs中的IDO表達(dá)，促進(jìn)抗Trp2的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，降低了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。此外，重組酒釀酵母遞送系統(tǒng)通過削弱免疫抑制，促進(jìn)Trp2特異性CD8+ T細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著抑制了小鼠黑色素瘤生長。

除了一些細(xì)胞載體外，也有一些是只基于細(xì)胞膜設(shè)計(jì)的遞送系統(tǒng)，具有生物組成、抗原成分和理化性質(zhì)方面的優(yōu)點(diǎn)。Guo Y等[47]采用紅細(xì)胞膜包裹PLGA納米粒，構(gòu)建了一種新型抗原肽遞送系統(tǒng)。該系統(tǒng)兼具PLGA納米粒的載藥功能和紅細(xì)胞膜的固有性質(zhì)。紅細(xì)胞可用于將抗原靶向遞送給DCs，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。作為抗原載體，紅細(xì)胞膜可以保護(hù)抗原不被血液清除，遞送抗原，APCs處理后直接將抗原遞送給免疫細(xì)胞[48]。將DSPE-PEG-甘露糖組裝到紅細(xì)胞膜上，構(gòu)建了DSPE-PEG-甘露糖-紅細(xì)胞膜載體，再將載有hgp的 PLGA納米粒(雙硫鍵連接hgp和PLGA)包裹其中，形成的遞送系統(tǒng)能夠有效靶向淋巴組織中的APCs，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)黑色素瘤均具有較好的療效。

3 小結(jié)

作為最難治療的腫瘤之一，晚期黑色素瘤一直處于腫瘤免疫治療的前沿[49]。除了免疫檢查點(diǎn)抑制劑外，一些其他新型免疫治療方式也正在探索發(fā)展中[50]，包括溶瘤病毒療法[51]和治療疫苗[52]等。但目前的黑色素瘤免疫治療存在不良反應(yīng)、響應(yīng)低和復(fù)發(fā)高等問題[18，53-54]。

納米遞送系統(tǒng)有望解決黑色素瘤免疫治療現(xiàn)存的問題。無機(jī)納米遞送系統(tǒng)，不僅能增強(qiáng)治療效果，還能實(shí)現(xiàn)成像和追蹤。有機(jī)納米遞送系統(tǒng)，既能保護(hù)免疫多肽和核酸不被降解，又能實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋控釋。細(xì)胞-納米仿生型遞送系統(tǒng)不僅能避免外源性遞送系統(tǒng)的高免疫原性，還能自主靶向，提高遞送效率，增強(qiáng)療效。

雖然將納米遞送系統(tǒng)應(yīng)用于黑色素瘤免疫治療的研究取得了許多進(jìn)展，但仍存在一些問題有待解決。如納米遞送系統(tǒng)所依賴的EPR效應(yīng)存在一定的局限性，無法應(yīng)用于腫瘤內(nèi)低灌注和缺氧的部分[55]。納米遞送系統(tǒng)進(jìn)入機(jī)體后，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，限制了其在黑色素瘤免疫治療中的實(shí)際應(yīng)用[56]，這些需要進(jìn)一步的研究改善。

近年來基于納米遞送系統(tǒng)的黑色素瘤免疫治療有了許多進(jìn)展，但還存在納米遞送的實(shí)際靶向效果遠(yuǎn)低于理論設(shè)計(jì)、機(jī)體免疫應(yīng)答的個(gè)體差異大和晚期黑色素瘤生存期短等問題?；诩{米遞送系統(tǒng)的黑色素瘤免疫治療有待進(jìn)一步研究和完善，以應(yīng)用于臨床。