張效苒，秦一丁，汪保華

(1.南通大學(xué)附屬中學(xué)，江蘇 南通226019；2.南通大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通226019)

1 引言

陸地棉(Gossypium hirsutum L.)作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的主要栽培種，具有豐產(chǎn)性好、適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，其產(chǎn)量占世界棉花總產(chǎn)量的90%，占中國棉花總產(chǎn)量的98%。棉花黃萎病(Verticillium dahliae Kleb)是棉花生長過程中會(huì)出現(xiàn)的一種危害較嚴(yán)重的土傳維管束系統(tǒng)病害，是一種世界性病害，其一般造成棉花產(chǎn)量損失10%～20%，嚴(yán)重時(shí)可以達(dá)到60%以上[1]，并且藥劑難于防治。近年來，棉花黃萎病在我國3大棉區(qū)內(nèi)連續(xù)肆虐，并且有逐年加重的趨勢(shì)，對(duì)棉花的生產(chǎn)造成了極大危害[2]。目前培育的棉花品種多為不抗病或不耐病的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)需求[3]，因此選育和推廣抗黃萎病的陸地棉品種還是主要的防治措施。

一般來說，植物基因組DNA會(huì)在逆境脅迫下發(fā)生甲基化水平的改變，而甲基化是DNA表觀遺傳學(xué)所研究的重要內(nèi)容之一。本研究采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation－sensitive amplified polymorphism，MSAP)技術(shù)[4，5]，并引入毛細(xì)管電泳檢測(cè)黃萎病脅迫下基因組DNA甲基化差異，分析黃萎病脅迫對(duì)陸地棉PD94042基因組DNA的影響；并對(duì)重要差異片段進(jìn)行克隆測(cè)序，從GenBank中尋找黃萎病抗性相關(guān)基因。本研究試圖從分子水平上研究黃萎病的抗性機(jī)制，為培育抗黃萎病棉花提供依據(jù)；同時(shí)希望從中發(fā)現(xiàn)黃萎病抗性的相關(guān)基因，服務(wù)于棉花的抗黃萎病分子育種。

2 材料與方法

2.1 棉花材料及其黃萎病接菌處理

本實(shí)驗(yàn)所用棉花材料為陸地棉(Gossypium hirsutum)材料PD94042，對(duì)黃萎病敏感(表1)。將配制好的PDA培養(yǎng)基經(jīng)120℃、15 min滅菌后，在無菌操作臺(tái)上倒入滅菌的平板內(nèi)。待培養(yǎng)基凝固后，用接種環(huán)將黃萎病菌涂布在平板上。放在28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期進(jìn)行觀察，并按上述方法進(jìn)行擴(kuò)盤純化。

取陸地棉種子30粒，然后種植到裝有營養(yǎng)土的紙杯中，在棉花長出4片真葉后，取生長健壯且長勢(shì)一致的20株幼苗，均分為4組，每組5株，去除紙杯底部分別放入4個(gè)盤子中。其中2個(gè)盤子裝有100 m L落葉型棉花黃萎病菌V991懸浮液作為接菌處理，另2個(gè)盤子裝有100 m L滅菌水作為對(duì)照，每天觀察陸地棉的長勢(shì)。夜間溫度控制在18～20℃，白天溫度控制在24～27℃。5 d后，接菌處理組便可明顯看出棉花葉片上出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，且葉片卷曲。取每個(gè)植株的第四片葉子放置在－80℃保存?zhèn)溆?。接菌后的?周，根據(jù)前人的判斷方法，將感病程度分為0，1，2，3，4，5個(gè)等級(jí)，定義如下：0表示健康的沒有疾病癥狀，而1，2，3，4分別表示葉片表面的病癥面積小于25.0%，25.1%～50.0%，25.1%～75.0%和大于75.0%的情況[6]。

2.2 DNA提取及MSAP分析

將每組棉花放置在－80℃冰箱中保存的第四片真葉取出，準(zhǔn)備提取基因組DNA和RNA。

用CTAB法提取棉花單株葉片DNA[7]。在用最終濃度20μg/m L核糖核酸酶在室溫下消化30 min可完全被消化DNA中的RNA?；诿?xì)管電泳的DNA甲基化檢測(cè)及差異條帶的克隆測(cè)序參照錢曉偉等[8]，接頭與引物序列見表2。

表2 用于MSAP分析的接頭和引物序列

同裂酶HpaⅡ和MspI都識(shí)別4堿基序列5’－CCGG：HpaⅡ不能酶切含雙鏈5mCCGG、C5mCGG、5mC5mCGG的位點(diǎn)，但能酶切半甲基化序列(單鏈甲基化)；而MspI能酶切單鏈或雙鏈上內(nèi)部胞嘧啶甲基化C5mCGG，但不能酶切外部胞嘧啶甲基化即含雙鏈或單鏈5mCCGG、5mC5mCGG的位點(diǎn)[9]。多態(tài)的比例(MSAP比例)可以使用以下公式計(jì)算MASP的多態(tài)性比例：

3 結(jié)果分析與討論

3.1 陸地棉基因組DNA甲基化水平

本研究利用MSAP法檢測(cè)了陸地棉黃萎病脅迫及對(duì)照下的DNA甲基化情況。MSAP分析中共選用了4個(gè)EcoR I選擇性擴(kuò)增引物，8個(gè)HpaⅡ/MspI選擇性擴(kuò)增引物，構(gòu)成32個(gè)引物組合，對(duì)陸地棉的黃萎病脅迫及對(duì)照下經(jīng)不同組合雙酶切所形成的4個(gè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增。毛細(xì)管電泳結(jié)果顯示，應(yīng)用32個(gè)引物組合，黃萎病脅迫及對(duì)照下均檢測(cè)出3440個(gè)CCGG位點(diǎn)(表3)，其中，甲基化位點(diǎn)分別為2989個(gè)和3038個(gè)，分別占總擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)的86.9%和88.3%；平均每引物組合檢測(cè)甲基化位點(diǎn)分別為93.4和94.9，黃萎病脅迫下的甲基化總位點(diǎn)數(shù)和對(duì)照組相比沒有顯著差異。

3.2 陸地棉的黃萎病脅迫和對(duì)照組基因組DNA甲基化模式的改變

所有的擴(kuò)增模式可分為A、B、C和D等4大類15個(gè)亞類(表4)。類型A包含4個(gè)亞類，表示與對(duì)照相比，黃萎病脅迫下的DNA甲基化模式?jīng)]有發(fā)生改變；且此種DNA甲基化模式變化類型占檢測(cè)總條帶的63.1%。類型B包含5個(gè)亞類，表明與對(duì)照相比，黃萎病脅迫下有16.6%位點(diǎn)DNA甲基化水平降低——次甲基化(hypomethylation)。同樣，類型C也包含5個(gè)亞類，該類型的陸地棉黃萎病脅迫下，基因組內(nèi)相應(yīng)位點(diǎn)DNA甲基化水平上升(超甲基化)且占18.4%位點(diǎn)。研究中還檢測(cè)到一種僅表現(xiàn)為甲基化模式的轉(zhuǎn)變但不能說明甲基化水平發(fā)生改變(類型D)，這種位點(diǎn)占總檢測(cè)位點(diǎn)2.1%(表4)。將24個(gè)引物組合擴(kuò)增后帶型類型進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)A、B、C、D帶型存在差異性(圖1)。

表3 MSAP檢測(cè)到的陸地棉D(zhuǎn)NA甲基化模式

3.3 克隆測(cè)序及Blast結(jié)果

對(duì)部分差異片段進(jìn)行回收及克隆測(cè)序。序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast查詢，比對(duì)得到與已知基因相似性較高的4個(gè)DNA片段，結(jié)果見表5。其中編號(hào)為W－124的基因序列與逆轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，編號(hào)為W－127的基因序列與陸地棉肌動(dòng)蛋白解聚因子2(ADF2)mRNA相關(guān)，編號(hào)為W－135的基因序列與赤霉素20－氧化酶基因(GA20ox3)有關(guān)，編號(hào)為W－161的基因序列與可可的泛素蛋白連接酶2(TCM_045033)mRNA有關(guān)。

表4 對(duì)照與黃萎病脅迫下DNA甲基化模式的變化

圖1 黃萎病處理后DNA甲基化不同變化模式比較

DNA甲基化是一種常見的DNA共價(jià)修飾方式，普遍存在于高等植物之中。它是將基因型和表型聯(lián)系起來的重要紐帶[23]。經(jīng)檢測(cè)，本次研究所使用的棉花品種陸地棉PD94042在黃萎病脅迫下的DNA甲基化情況中的大部分位點(diǎn)(63.1%)的甲基化水平?jīng)]有發(fā)生顯著差異；而甲基化狀態(tài)發(fā)生變化的位點(diǎn)中，黃萎病脅迫下發(fā)生超甲基化的位點(diǎn)數(shù)略高于發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)在各種甲基化類型中比例最高的是類型Ⅲ，即在黃萎病脅迫下雙鏈外部胞嘧啶發(fā)生甲基化或雙鏈內(nèi)外部都發(fā)生甲基化的位點(diǎn)數(shù)有所升高。此外，陸地棉PD94042在黃萎病脅迫下總體甲基化位點(diǎn)數(shù)略高于對(duì)照組，但沒有達(dá)到顯著水平。為了更加深入地探究陸地棉抗黃萎病的分子機(jī)制，對(duì)部分甲基化差異序列進(jìn)行了克隆和BLAST搜索分析，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)序列與已知基因高度相似，包括逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因、肌動(dòng)蛋白解聚因子基因、逆轉(zhuǎn)錄酶基因、赤霉素20－氧化酶基因以及泛素蛋白連接酶基因等。這些基因的表達(dá)，可能與棉花對(duì)黃萎病的抗性相關(guān)。后續(xù)將選用更多的抗病性不同的棉花材料，對(duì)黃萎病脅迫下的棉花抗病分子機(jī)理開展更加深入的研究。

表5 差異序列的BLAST分析結(jié)果