謝體波，龔維瑤，鐘新敏，吳紫潔，程茹，張凱，袁光宇

(貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司，貴州 貴陽(yáng)，550009)

動(dòng)物源性食品中獸藥殘留對(duì)人體健康的影響已成為食品安全問(wèn)題之一，獸藥的殘留最終會(huì)富集人體內(nèi)而影響人類健康。磺胺類藥物作為抗生素使用受到廣泛關(guān)注，該藥物具有抗菌廣譜、藥效穩(wěn)定、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑與動(dòng)物疫病治療[1-3]。在缺乏有效監(jiān)管的情況下被過(guò)分濫用，導(dǎo)致許多動(dòng)物源性食品中大量殘留。我國(guó)農(nóng)業(yè)部及歐美國(guó)家都規(guī)定了磺胺類在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量0.1mg/kg。

目前，對(duì)磺胺類藥物殘留檢測(cè)主要通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)[4-5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)[7-8]與酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[9-10]。前三者相對(duì)專業(yè)操作強(qiáng)、大型儀器難以實(shí)現(xiàn)市場(chǎng)普及、快速檢測(cè)難以實(shí)現(xiàn)等問(wèn)題，而ELISA具有微量分析方法成熟、使用方便、經(jīng)濟(jì)易行等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測(cè)方法中試劑盒法因其檢測(cè)敏感性高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好，試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易判讀等特點(diǎn)，能夠很好的適合大批量快速檢測(cè)[11-12]。現(xiàn)階段市場(chǎng)檢測(cè)磺胺藥物試劑盒種類較多，但檢測(cè)相對(duì)單一[13-15]。因此，開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)多種動(dòng)物性食品中磺胺類藥物殘留檢測(cè)ELISA試劑盒具有很高的實(shí)用價(jià)值。

本研究的目的是通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)板制備條件及檢測(cè)方法的建立，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)市場(chǎng)動(dòng)物源性食品中殘留的磺胺類藥物的檢測(cè)；另外，對(duì)試劑盒的穩(wěn)定性驗(yàn)證，并與HPLC法就市場(chǎng)上部分動(dòng)物源性食品進(jìn)行抽檢對(duì)比，已確定建立的試劑盒檢測(cè)方法的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品購(gòu)自各大農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及超市；抗原、單克隆抗體由北京勤邦公司提供；磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度均≥99.0%；96孔酶標(biāo)板，廈門云鵬科技有限公司；ST-360型酶標(biāo)儀，上?？迫A生物股份有限公司；化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備

磺胺類藥物為小分子化合物，不具有免疫原性，將乙酰氨基苯磺酸與對(duì)氨基苯甲酸合成磺胺類半抗原，再將磺胺類藥物半抗原與BSA偶聯(lián)，分析計(jì)算結(jié)合比為15∶1。

1.2.2 檢測(cè)參數(shù)的建立

(1)包被液的篩選。對(duì)比3種包被緩沖液：0.02 mol/L pH=7.2的PBS緩沖液，0.05 mol/L pH=9.6的碳酸鹽緩沖液，0.02 mol/L pH=7.2的Tris緩沖液，篩選最佳包被緩沖溶液。

(2)抗體、酶標(biāo)二抗稀釋液的篩選。對(duì)比3種抗體稀釋液：常規(guī)抗緩A，含0.1%明膠抗緩B，含0.1%甘油抗緩C。

(3)抗原、抗體和酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊拇_定。采用控制變量法和參考羅貴昆等[16]的參數(shù)確定方法結(jié)合檢測(cè)IC50值、雞肉樣品添加回收和吸光度值選定最佳濃度。

(4)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間和顯色時(shí)間的確定。分別設(shè)定競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為0、15和30 min；顯色時(shí)間分別設(shè)定為5、15、30和45 min。對(duì)比反應(yīng)吸光度值確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.3 ELISA方法的建立

配制磺胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容后逐級(jí)稀釋配制以下質(zhì)量濃度：1、3、9、27和81 ng/mL溶液。按照以下步驟操作：①設(shè)置0標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，按標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度加入50 μL/孔，每個(gè)梯度設(shè)兩孔，每孔加入50 μL SAs單克隆抗體，25 ℃孵育上述最佳競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間后，0.01% Tween-20 0.01 mol/L pH=7.2的PBS緩沖液洗板3～5次；②加入酶標(biāo)二抗，25 ℃孵育后，洗板3～5次；③加入100 μL/孔TMB避光顯色上述最佳顯色時(shí)間后，50 μL/孔2 mol/L硫酸終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀450/630 nm測(cè)定OD值。

1.2.4 樣品添加回收實(shí)驗(yàn)

在蝦仁、豬肉、雞肉、牛奶中添加不同濃度的磺胺藥物標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)設(shè)計(jì)回收方法計(jì)算添加回收率和批間、批內(nèi)變異系數(shù)來(lái)確定試劑盒準(zhǔn)確度。蝦仁、豬肉、雞肉、牛奶樣品添加3組不同濃度磺胺藥物，且每組設(shè)3個(gè)平行，用3個(gè)不同批次試劑盒檢測(cè)。稱取2.0 g均質(zhì)后的蝦仁、豬肉、雞肉樣本，添加磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品；加入5～10 mL乙腈-乙酸乙酯溶液混勻，3 000 r/min室溫離心5 min；移取上層有機(jī)相至10 mL玻璃試管，50～60 ℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加? mL正己烷和1 mL PBS混勻，3 000 r/min室溫離心5 min，除去上層有機(jī)相，下層水相用于分析。向牛奶中添加磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，3 000 r/min室溫離心15 min，除去脂肪用于檢測(cè)。

1.2.5 特異性

特異性是指交叉反應(yīng)率，抗體與抗原發(fā)生結(jié)合的能力強(qiáng)弱。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定磺胺類藥物IC50值，選擇不同磺胺藥物類似結(jié)構(gòu)的藥物測(cè)定IC50值，計(jì)算交叉反應(yīng)率來(lái)判斷試劑盒檢測(cè)的特異性。

(1)

1.2.6 穩(wěn)定性

4 ℃穩(wěn)定性試驗(yàn)，從3批試劑盒中各抽出6組試劑盒，每組3盒試劑盒，每組均做4 ℃ 4個(gè)時(shí)間段第0、1、3、6月的保存試驗(yàn)。分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的變化，檢測(cè)數(shù)據(jù)變異系數(shù)。

1.2.7 試劑盒技術(shù)參數(shù)的確定

選取3批試劑盒分別檢測(cè)蝦仁、豬肉、雞肉、牛奶樣本，并將靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度與HPLC檢測(cè)的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 包被液和抗體、酶標(biāo)二抗稀釋液的測(cè)定

通過(guò)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析，確定優(yōu)化后的包被緩沖液選擇0.05 mol/L pH=9.6的碳酸鹽緩沖液；抗體、酶標(biāo)二抗稀釋液選擇常規(guī)抗緩A。

2.2 抗原、抗體和酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊臏y(cè)定

對(duì)IC50、50 μg/kg添加雞肉回收率和最大吸光度值的比較確定抗原的包被濃度。抗體和酶標(biāo)二抗的濃度分別為20 000、2 000比較結(jié)果見(jiàn)表1。由表1結(jié)果可知包被抗原濃度與IC50值負(fù)相關(guān)，抗原稀釋2×104倍IC50與最大吸光度值均較好。表2結(jié)果表明抗體濃度在2×104倍稀釋時(shí)，最大吸光度值、樣品添加回收率和IC50均處于最佳狀態(tài)，兩者濃度比為2×104∶4 000時(shí)由于酶標(biāo)二抗的濃度降低，靈敏度不高。

表1 抗原濃度的測(cè)定Table 1 The determination of antigen concentration

表2 抗體和酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊臏y(cè)定Table 2 The determination of antibody concentration and enzyme labelled antibody concentration

2.3 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間和顯色時(shí)間的測(cè)定

不同的孵育時(shí)間結(jié)果見(jiàn)表3。在25 ℃環(huán)境中，50 μL/孔樣品溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入50 μL/孔單抗工作液，加入酶標(biāo)二抗0、15和30 min后的時(shí)間比對(duì)，結(jié)果表明加入酶標(biāo)二抗的時(shí)間為30 min時(shí)，吸光度值、IC50和曲線線性均較好。

表3 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間的測(cè)定Table 3 The determination of competitive reaction time

不同時(shí)間加入終止液，終止底物顯色液與酶的反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4結(jié)果可知吸光度值與時(shí)間成正相關(guān)，15 min的顯色反應(yīng)，其吸光度值與IC50值均較好，且曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.993。

表4 顯色時(shí)間的測(cè)定Table 4 The determination of coloration time

2.4 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

建立競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。通過(guò)計(jì)算曲線參數(shù)方程為y=-0.387 7x+0.728，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 8，說(shuō)明試劑盒線性關(guān)系良好，IC50值為3.88 ng/mL，線性檢測(cè)范圍1.18～41.67 ng/mL。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 standard curve

2.5 準(zhǔn)確度(添加回收實(shí)驗(yàn))

將磺胺類藥物添加至終濃度為10、50、100 μg/kg，每種樣品、每個(gè)濃度各5個(gè)平行，用試劑盒提供的操作方法測(cè)定。抽取3批試劑盒，每批試劑盒測(cè)定同一份樣品3次，分別計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)及回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知磺胺類藥物在四類動(dòng)物源性樣品中回收率在67.4%～117%，批間變異系數(shù)<10%，批內(nèi)變異系數(shù)<10%。

表5 準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果Table 5 Results of accuracy on chicken samples

2.6 特異性

競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、酞?；青邕?、磺胺甲噻二唑、磺胺吡啶的IC50及交叉反應(yīng)率，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知該試劑盒對(duì)磺胺類似藥物的交叉反應(yīng)率均較高，對(duì)幾種藥物均具有較高的特異性。

2.7 穩(wěn)定性

選3批試劑用于確定試劑盒的穩(wěn)定性，4 ℃條件保存。放置0、30、90與180 d后測(cè)定磺胺類藥物的回收率和批內(nèi)差異，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知該試劑盒在4 ℃條件保存各時(shí)間段在樣品中的添加回收率差異不顯著，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均<10%，各項(xiàng)參數(shù)穩(wěn)定。說(shuō)明該試劑盒能夠長(zhǎng)期保存。

表7 穩(wěn)定性的測(cè)定Table 7 Determination of the stability of kit

2.8 與高效液相色譜結(jié)果比較

2.8.1 靈敏度的比較

用本試劑盒建立方法和高效液相色譜法[17]分別測(cè)定市場(chǎng)隨機(jī)抽選的蝦仁、雞肉、豬肉、牛奶樣品各5分，共計(jì)20份樣品，結(jié)果見(jiàn)表8。自制試劑盒檢測(cè)方法中，取3個(gè)批次試劑盒，3個(gè)平行，求平均值；由于儀器方法的最低檢測(cè)限為10 μg/kg，低于10 μg/kg的樣品用“-”符號(hào)表示。由表9可知試劑盒建立方法和高效液相色譜法陰陽(yáng)性結(jié)果復(fù)核率為100%，檢測(cè)20個(gè)樣品共有10個(gè)樣品為陽(yáng)性樣品。

表8 靈敏度比較Table 8 Comparison of the sensitivity of ELISA and HPLC

2.8.2 準(zhǔn)確度和精密度的比較

用同樣方法，以50 μg/kg濃度對(duì)空白蝦仁、雞肉、豬肉、牛奶樣品進(jìn)行磺胺類藥物添加回收試驗(yàn)，比較儀器檢測(cè)方法和自制試劑盒檢測(cè)方法的平均回收率和變異系數(shù)。自制試劑盒檢測(cè)方法中，取3個(gè)批次試劑盒，3個(gè)平行，計(jì)算變異系數(shù)。

由表9可知高效液相色譜檢測(cè)方法以50 μg/kg濃度添加，回收率在85.0%～93.7%，變異系數(shù)在1.7%～6.0%。自制試劑盒以50 μg/kg濃度添加時(shí)，回收率在75.6%～112%，批間變異系數(shù)<10%，批內(nèi)變異系數(shù)<10%，適于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表9 準(zhǔn)確度和精密度比較結(jié)果Table 9 Comparison of the accuracy and accuracy of ELISA and HPLC

3 討論

不同包被緩沖液的選擇及抗原、抗體和酶標(biāo)二抗?jié)舛扰浔葘?duì)IC50、吸光度值均有較大影響。對(duì)比結(jié)果表明3種包被緩沖液中碳酸鹽緩沖液優(yōu)于其他2種緩沖液，更利于抗原吸附于本研究用酶標(biāo)板。另外，隨著包被抗原稀釋濃度在一定范圍增加，IC50、吸光度值均降低，最終確定最佳包被抗原稀釋2×104倍；抗體∶酶標(biāo)二抗的相對(duì)比對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)也有較大影響，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知抗體濃度的降低，吸光度值隨之降低，酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊慕档?，靈敏度下降。綜合考慮IC50、吸光度值及添加回收率選擇最佳比例2×104∶2000。

在反應(yīng)時(shí)間上的確定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示隨著最佳反應(yīng)時(shí)間之后繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，所得曲線相關(guān)系數(shù)呈下降趨勢(shì)，結(jié)果與真實(shí)值相差較大。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定了試劑盒的檢測(cè)方法：樣品溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL/孔，抗體工作液50 μL/孔，在25 ℃反應(yīng)30 min，洗板，加入酶標(biāo)二抗100 μL/孔，在25 ℃反應(yīng)30 min，加入底物顯色液100 μL/孔，在25 ℃反應(yīng)15 min，終止，酶標(biāo)儀于450/630 nm測(cè)定OD值。

對(duì)于試劑盒的穩(wěn)定性驗(yàn)證，僅進(jìn)行了4 ℃條件下保存，有一定的局限性。沒(méi)有能夠覆蓋多個(gè)差異溫度，因此在實(shí)際市場(chǎng)使用過(guò)程中還有待驗(yàn)證，但本試劑盒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍屬于較好范圍內(nèi)，只要進(jìn)行合理的保存，仍然能夠滿足市場(chǎng)的檢測(cè)需求。本研究通過(guò)對(duì)動(dòng)物源性食品添加回收建立的樣品分析方法與HPEC檢測(cè)方法檢測(cè)市場(chǎng)樣品，檢測(cè)陰陽(yáng)性結(jié)果復(fù)核率為100%，準(zhǔn)確度、精密度數(shù)據(jù)符合度均較高，表明本試劑盒能夠滿足HPLC樣品初篩和適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。