張曉潔,馬良,馬明思,鄭紅,孫藝,張宇昊

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

明膠是由動(dòng)物皮膚、骨、肌膜、肌腱等結(jié)締組織中的膠原部分降解而成的天然生物高分子材料之一，因其具有良好的膠凝性、溶脹性和成膜性等，被廣泛應(yīng)用于食品、材料、醫(yī)藥和攝影行業(yè)[1]。明膠屬于熱可逆型凝膠，環(huán)境溫度的升高會(huì)降低明膠的凝膠特性，進(jìn)而影響產(chǎn)品品質(zhì)，這大大限制了明膠在食品工業(yè)的應(yīng)用范圍。因此如何改善明膠的凝膠特性成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

目前，明膠凝膠特性的改善有化學(xué)和物理方法，物理方法主要包括紫外照射、γ輻照和超高壓[2]，KULISIEWICZ等[3]研究發(fā)現(xiàn)將明膠于200MPa下作用30min后，與對(duì)照相比，明膠的儲(chǔ)能模量提高到四倍，凝膠特性也得到改善。物理方法雖不會(huì)引入外源性物質(zhì)，但存在明膠復(fù)性和均一性較差等問(wèn)題?；瘜W(xué)方法主要是將戊二醛、碳化二亞胺、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和京尼平等化學(xué)交聯(lián)劑加入到明膠中，通過(guò)與明膠鏈之間的交聯(lián)作用來(lái)改善凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得明膠性能得以提高[4-5]，MOHTAR等[6]將戊二醛加入魚(yú)皮明膠中，發(fā)現(xiàn)明膠的凝膠強(qiáng)度和儲(chǔ)能模量都有所提高，但是有些交聯(lián)劑具有毒性，它們?cè)谑称泛歪t(yī)藥上的應(yīng)用是不可接受的。近年來(lái)，將天然酚類提取物加入到明膠中，通過(guò)明膠與酚類物質(zhì)之間的共價(jià)或非共價(jià)相互作用來(lái)提高明膠的機(jī)械和流變性能已得到廣泛應(yīng)用[7]。YASIN等[8]將檸檬草提取物加入雞腳明膠中，發(fā)現(xiàn)明膠的凝膠強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性和彈性模量都有所提高；TEMDEE等[9]將富含丹寧酸的腰果樹(shù)皮提取物加入到烏賊皮明膠中，明膠的凝膠強(qiáng)度有顯著性提高。

GMEZESTACA等[10]將迷迭香提取物加入到金槍魚(yú)皮中，發(fā)現(xiàn)明膠凝膠強(qiáng)度和損耗模量都有提高，但由于迷迭香提取物為混合物，無(wú)法明確其改善明膠凝膠特性的成分及改善機(jī)制。迷迭香酸(RosA)是迷迭香提取中主要成分之一，屬于天然多酚化合物[11]，具有良好的抗氧化性、抗菌、抗炎和抗病毒活性[12]。本研究以RosA和兔皮明膠為原料，將不同質(zhì)量濃度的RosA加入明膠中，通過(guò)熒光光譜、凝膠強(qiáng)度、流變學(xué)性能和圓二色譜等方法研究明膠與RosA之間的相互作用，分析該相互作用對(duì)明膠的影響，為提高明膠的理化性質(zhì)和后期明膠-RosA可食性膜的制備提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兔皮，購(gòu)于重慶阿興記食品有限公司，原料獲取后洗凈凍藏于-20 ℃冰箱中備用。Ca(OH)2、HCl、Na2S、Nacl、(NH4)2S2O8、二甲基硅油和十二烷基硫酸鈉，成都市科龍化工試劑廠；迷迭香酸(純度97%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-巰基乙醇(2-ME)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍(lán)R-250和四甲基乙二胺(TEMED)，加拿大BIO BASIC公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%丙烯酰胺，北京索萊寶科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白為(分子質(zhì)量 10～200 kDa)，加拿大Fermentas公司。其中Tris、考馬斯亮藍(lán)R-250、30%丙烯酰胺為優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

JA3003B型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；PE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HX-1005恒溫循環(huán)器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；MOS-500圓二色譜儀，法國(guó)Bio-Logic公司；F-4500 熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；Power PacTM基礎(chǔ)電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；G: BOX EF型凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)Syn-gene公司；DHR-1流變儀，美國(guó)TA公司；TA.XT2i物性測(cè)定儀，英國(guó)Stable Micro System公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 兔皮明膠的制備

兔皮明膠的提取方法主要參照楊暉等[13]報(bào)道的基礎(chǔ)上，具體工藝如下：

新鮮兔皮→去除皮下脂肪→脫毛→清洗、剪切→除雜蛋白→清洗→稀酸處理(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸)→提膠→過(guò)濾(用1.6 μm孔徑的濾膜真空過(guò)濾)→熱風(fēng)干燥→成品明膠。

所得明膠的提取率為(80.25±1.71)%，純度為(93.55±1.42)%。

1.3.2 樣品的制備

稱取2 g明膠于燒杯中，加入20 mL蒸餾水于60 ℃下溶解，分別配制質(zhì)量濃度為0、2.4、4.5、9.0和15 g/L的RosA溶液加入明膠溶液中，制成RosA的最終濃度為0、0.8、1.5、3.0和5.0 g/L的明膠溶液，明膠的最終濃度為66.7 g/L。以上溶液充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅?0 ℃下保溫30 min得到明膠-RosA共混溶液，之后在室溫下冷卻成膠。

1.3.3 熒光光譜分析

按照1.3.2方法配制一系列所需濃度的RosA-明膠共混溶液。用蒸餾水將共混液稀釋成明膠濃度為1 mg/mL，相應(yīng)的RosA溶液濃度為0～0.07 mg/mL，分別于298、308和318 K下測(cè)定熒光光譜。熒光光譜條件為：激發(fā)波長(zhǎng)λex=278 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=305 nm，波長(zhǎng)范圍280～400 nm，入射和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。同時(shí)，為了明確RosA對(duì)明膠的熒光淬滅方式，采用Stern-Vomler方程計(jì)算[14]。

(1)

式中：F0和F分別為未加和加入RosA時(shí)明膠的熒光強(qiáng)度；[Q]為RosA的濃度，Ksv為Stern-Vomler猝滅常數(shù)，Kq為雙分子作用的動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)，τ0為熒光分子的平均壽命，一般為10-8s[15]。

1.3.4 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參照GB 6783—2013[16]中凝膠強(qiáng)度的測(cè)定方法，將1.3.2配制的樣品在(10±0.1)℃恒溫循環(huán)器中凝凍16～18 h，采用TA.XT2i物性測(cè)定儀測(cè)定凝膠強(qiáng)度。用SMSP/0.5圓柱型探頭以1 mm/s的下壓速度壓入凝膠4 mm，得出凝膠強(qiáng)度數(shù)值。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 流變性能的測(cè)定

采用DHR-1流變儀測(cè)定1.3.2配制的樣品的黏彈性。流變儀的參數(shù)設(shè)置主要參照陳麗清等[17]，測(cè)試夾具40 mm Al平板，板間距為0.10 mm，樣品于流變儀上由40 ℃冷卻到5 ℃，在5 ℃下保持2 min，然后由5 ℃加熱到40 ℃，測(cè)定儲(chǔ)能模量G′和損耗模量G″隨溫度掃描的變化并計(jì)算相角δ，在動(dòng)態(tài)黏彈性分析中，通常以tanδ= 1作為明膠膠凝和熔化溫度的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，分別對(duì)應(yīng)于膠凝溫度和熔化溫度。

1.3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)

將1.3.2配制的樣品用蒸餾水稀釋成明膠濃度為2 mg/mL，按體積比 4∶1添加樣品緩沖液充分混勻，沸水浴5 min，冷卻后上樣[9]。上樣量為10 μL，其中分離膠和濃縮膠的濃度分別為10%和5%，電流初始設(shè)置為 15 mA，待溴酚藍(lán)跑到分離膠中后，電流調(diào)至 25 mA，電泳時(shí)間約1 h。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色，2 h后用脫色液于30 ℃下振蕩脫色，直至背景藍(lán)色被脫凈，然后用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜并用Gene Tools數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析。

1.3.7 圓二色譜分析(circular dichroism, CD)

將1.3.2配制的樣品用蒸餾水稀釋成明膠濃度為1 mg/mL，并進(jìn)行圓二色譜分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。測(cè)定波長(zhǎng)范圍為190～240 nm，反應(yīng)條件為25 ℃，比色皿光程為1 mm，掃描速度為50 nm/min，記錄橢圓率并用圓二色軟件CDPro計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Origin 8.6和SPSS 17.0軟件分析，每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析

在構(gòu)成明膠分子的18種氨基酸中，只有酪氨酸有熒光產(chǎn)生，其中酪氨酸的發(fā)射波長(zhǎng)在304 nm左右。如圖1所示，RosA的加入造成熒光淬滅，使得熒光強(qiáng)度降低，說(shuō)明兩者可能存在相互作用。通常來(lái)講，熒光淬滅可以分為動(dòng)態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅，動(dòng)態(tài)猝滅依賴于擴(kuò)散，即溫度的上升能夠增加分子的有效碰撞，因此Ksv也會(huì)隨著溫度的升高而增大，說(shuō)明熒光淬滅主要是由分子碰撞造成，未產(chǎn)生分子間相互作用；而靜態(tài)猝滅是由于猝滅分子和熒光發(fā)色團(tuán)結(jié)合而生成了一種基態(tài)復(fù)合物，隨著溫度的升高基態(tài)復(fù)合物的穩(wěn)定性將會(huì)降低，因此Ksv將會(huì)隨著溫度的升高而減小[18]，說(shuō)明分子間產(chǎn)生相互作用。

圖1 RosA對(duì)明膠熒光光譜的影響Fig.1 Effects of RosA on the fluorescence spectra of gelatin 注：λex=278 nm，明膠濃度為1 mg/mL，a-g代表加入的RosA濃度 為0、0.004、0.007、0.01、0.02、0.04、0.07 mg/mL。

由圖2和表1可知，隨著溫度的升高，Ksv在逐漸減少，說(shuō)明明膠與RosA之間發(fā)生了相互作用，形成復(fù)合物，此外，Kq值(表1)的數(shù)量級(jí)遠(yuǎn)大于動(dòng)態(tài)猝滅的最大猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)，同樣說(shuō)明兩者之間為靜態(tài)猝滅方式，產(chǎn)生了分子間的相互作用。

圖2 不同溫度下RosA對(duì)明膠熒光光譜的影響Fig.2 Effects of RosA on the fluorescence spectra of gelatin at different temperatures

表1 三種溫度下RosA與明膠相互作用的猝滅常數(shù) (Ksv)和速率常數(shù)(Kq)Table 1 The stern-volmer quenching constants and rate constants of gelatin quenched by RosA at different temperatures

溫度/K猝滅常數(shù)Ksv×10-5/(L·moL-1)速率常數(shù)Kq×10-12/[L·(mol·s)-1]R22980.5775.770.997 93080.5335.330.991 03180.4954.950.993 1

2.2 凝膠強(qiáng)度

如圖3所示，當(dāng)RosA質(zhì)量濃度為0.8 g/L時(shí)，凝膠強(qiáng)度無(wú)顯著性變化(p>0.05)，隨著RosA質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，明膠凝膠強(qiáng)度顯著增加(p<0.05)，當(dāng)濃度為5 g/L時(shí)，凝膠強(qiáng)度由459.547 g增至548.01 g，與GMEZESTACA等[10]研究結(jié)果一致。GMEZESTACA等[10]將迷迭香提取物加入到魚(yú)皮和牛皮明膠，凝膠強(qiáng)度都有顯著提高，這歸因于明膠與酚類物質(zhì)之間的非共價(jià)相互作用。RosA的添加可以增強(qiáng)明膠凝膠強(qiáng)度，可能是因?yàn)橐环肿覴osA中含有的4個(gè)酚羥基和1個(gè)羧基，可能分別與明膠分子中N-H基團(tuán)結(jié)合形成氫鍵，從而起到了明膠分子間“橋梁”的作用，增加了凝膠體系的緊密度，使得凝膠強(qiáng)度增加[19]。也就是說(shuō)明膠與酚類之間的非共價(jià)作用在其中起到主導(dǎo)。KAEWDANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，添加一定濃度的椰子殼提取物可以顯著提高金槍魚(yú)鰾明膠的凝膠強(qiáng)度，這是由于椰子殼中主要物質(zhì)是丹寧酸，丹寧酸與明膠之間主要通過(guò)氫鍵或疏水作用產(chǎn)生相互作用，有助于形成更強(qiáng)的凝膠網(wǎng)絡(luò)，使得凝膠強(qiáng)度增加，該結(jié)論與本研究分析一致。

圖3 含有不同濃度RosA的明膠的凝膠強(qiáng)度Fig.3 Gel strength of gelatin incorporated with RosA at different concentrations

2.3 流變性能

如圖4所示，在凝膠體系下(低溫)，RosA的添加可以增加明膠的G′和G″，但G′和G″隨RosA的添加量的增加變化趨勢(shì)不同，隨著RosA質(zhì)量濃度的增加，明膠樣品的G′呈先增加后下降的趨勢(shì)，G″呈現(xiàn)單純上升趨勢(shì)。MOHTAR等[6]研究表明將咖啡酸加入到魚(yú)皮明膠中，明膠樣品的G′隨著咖啡酸濃度的增加先升高后降低；GMEZESTACA等[10]研究表明將高濃度的迷迭香提取物加入到金槍魚(yú)皮明膠中，明膠樣品的G″有明顯提高，這是由于明膠部分肽鏈在形成凝膠過(guò)程中并沒(méi)有直接參與到蛋白凝膠基質(zhì)中，而是與酚類物質(zhì)之間發(fā)生了相互作用。這些均與本研究結(jié)果一致。

這可能是因?yàn)楫?dāng)RosA添加量達(dá)到5 g/L時(shí)，由于大量的酚羥基和羧基造成了明膠鏈的凝聚，形成了明膠-RosA的絡(luò)合物，此時(shí)明膠凝膠的透明度降低可以說(shuō)明這一推測(cè)的合理性。絡(luò)合物的形成可能影響了明膠分子形成類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成，從而降低了凝膠體系的彈性，造成G′的降低。但是由于RosA為連接的蛋白聚集體的大量存在，賦予了凝膠更好的黏性，使得G″進(jìn)一步升高。

圖4 含有不同濃度RosA明膠在升溫和降溫過(guò)程中的儲(chǔ)能模量和損耗模量的變化Fig.4 Evolution of G′ and G″ during heating and cooling processes of gelatin incorporated with RosA at different concentrations

由圖5可知，RosA的加入并沒(méi)有顯著性地改變明膠樣品的的膠凝和熔化溫度，這說(shuō)明明膠在形成凝膠和溶膠過(guò)程中，RosA并未參與類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成，GMEZESTACA等[10]將迷迭香提取物分別加入到魚(yú)皮和牛皮明膠中，發(fā)現(xiàn)明膠樣品的膠凝和熔化溫度并未發(fā)生顯著性變化，說(shuō)明添加迷迭香提取物對(duì)明膠類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成只有微小干擾；GMEZGUILLéN等[21]將默塔葉提取物加入到魚(yú)皮明膠中也得到相似的結(jié)果，含有默塔葉提取物的明膠與單純明膠都具有相同的熔化溫度。此結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

圖5 含有不同濃度RosA明膠的膠凝和熔化溫度Fig.5 Gelation and melting temperature of gelatin incorpo- rated with RosA at different concentrations

2.4 凝膠電泳分析

如圖6所示，不同的明膠樣品均含有明顯的β、α1和α2鏈，與對(duì)照相比，含有RosA的明膠樣品并無(wú)明顯區(qū)別，這是因?yàn)镽osA與明膠之間主要是形成氫鍵等非共價(jià)作用，在電泳條件下，全部被SDS破壞。KAEWDANG等[21]將一定濃度的椰子殼提取物(主要物質(zhì)是丹寧酸)加入到金槍魚(yú)鰾明膠中，同樣發(fā)現(xiàn)電泳圖譜并無(wú)明顯區(qū)別，這是因?yàn)橐託ぬ崛∥锱c魚(yú)鰾明膠之間主要發(fā)生氫鍵或疏水相互作用，SDS溶液能夠破壞這些弱鍵，使得圖譜沒(méi)有明顯差異。

圖6 含有不同濃度RosA明膠的SDS電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE pattern of gelatin incorporated with RosA at different concentrations 注：M代表Maker,1,2,3,4,5分別代表迷迭香酸質(zhì)量濃度為 0、0.8、1.5、3、5 g/L。

2.5 圓二色譜分析

圓二色譜法可以有效測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)而廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)之間的相互作用。研究表明[22]，明膠通常在198 nm處有一負(fù)峰，在220 nm處有一正峰，不同的出峰位置可能與明膠的種類和提取方法有關(guān)。此外，在208 nm和222 nm處負(fù)特征峰與α螺旋結(jié)構(gòu)的存在有關(guān)，在195 nm處正峰和216 nm處負(fù)峰與β折疊有關(guān)[23]。

由圖7和表2可知，所有的明膠樣品均在210 nm和222 nm處有明顯的負(fù)峰和正峰，RosA的加入并沒(méi)有使明膠樣品的正負(fù)吸收峰位置發(fā)生偏移，但隨著RosA濃度的增加，吸收峰的強(qiáng)度在逐漸減少。

圖7 含有不同濃度RosA明膠的圓二色譜圖Fig.7 CD spectra of gelatin incorporated with RosA at different concentrations 注：a-e分別代表RosA質(zhì)量濃度為0、0.8、1.5、3、5 g/L。

RosA的加入使得α螺旋結(jié)構(gòu)部分解旋，α螺旋含量降低，β折疊含量升高，這可能是因?yàn)镽osA的加入使得明膠肽鏈結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)。α螺旋主要靠分子內(nèi)的羰基氧和氨基氫之間形成的氫鍵維持穩(wěn)定[24]， RosA含有的酚羥基和羧基與明膠的氨基之間形成新的氫鍵，進(jìn)而破壞明膠原有的氫鍵平衡，從而導(dǎo)致α螺旋的解旋，同時(shí)伴隨著β折疊的形成。

表2 含有不同濃度RosA明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 2 Secondary structural analysis of gelatin incorpo- rated with RosA at different concentrations

3 結(jié)論

本研究分析了兔皮明膠與RosA之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)RosA能對(duì)明膠產(chǎn)生很強(qiáng)的猝滅效果，且猝滅機(jī)制為生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。RosA可以提高明膠的凝膠強(qiáng)度，使明膠的黏性和彈性都有所增加，但對(duì)膠凝和熔化溫度沒(méi)有明顯影響，這可能是由于RosA與明膠之間通過(guò)氫鍵發(fā)生作用，并在明膠分子間起到“橋梁作用”，但對(duì)于明膠類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成沒(méi)有明顯影響。SDS-PAGE結(jié)果也證實(shí)了經(jīng)過(guò)前處理后，RosA與明膠的相互作用全被破壞，使得電泳圖譜沒(méi)有明顯區(qū)別，說(shuō)明它們之間相互作用為非共價(jià)作用。圓二色譜分析表明，隨著RosA的添加量增加，明膠結(jié)構(gòu)展開(kāi)，α螺旋含量減少，β折疊含量增加。