戰(zhàn)妍妃， 李媛媛， 安欣欣， 周洪雷

(山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟南 250355)

石韋屬(PyrrosiaMirbel)屬于蕨類植物水龍骨科，主要藥材品種為廬山石韋、有柄石韋和石韋，又名金星草、石皮、石劍等.始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，中醫(yī)認為石韋味甘、苦，性微寒，入肺、膀胱經(jīng)，有利水通淋、清肺泄熱等作用[1]，用于治療慢性氣管炎、肺熱咳喘、金瘡尿痛、腎炎尿血[2-6]等.石韋屬全世界約70種，我國遍布極廣，主要分布在西北、華北等地，極易采集[7].

近年來，傳統(tǒng)的中藥材在抗病毒方面受到人們的重視，山東中醫(yī)藥大學(xué)科研室也一直致力于這方面的研究，并且從石韋中提取得到了藥物的有效成分, 即石韋黃酮，石韋黃酮通過采用標準病毒株或臨床分離病毒株進行活性檢測[8]，探究石韋黃酮的抗病毒效果，并且用HPLC-MS鑒定并分析黃酮部位成分[9].為進一步研究石韋的抗病毒活性提供了依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株與細胞株

病毒株：腸道EV-71病毒(human enterovirus71，EV-71)、單純皰疹I(lǐng)型病毒(herpes simplex virus I，HSV-1)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)(引自中國疾病預(yù)防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室)；細胞株：惡性胚胎橫紋肌瘤細胞(RD細胞，為EV-71病毒敏感細胞、非洲綠猴腎細胞(vero細胞，為HSV-1、RSV 敏感細胞)(由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究所微生物室提供).

1.1.2 對照品

咖啡酸對照品(批號：Y17D6C7672)、綠原酸對照品(批號：Y24J7K16726)、槲皮素對照品(批號：C20J6Y1722)、木樨草素對照品(批號：Y01D656815)、山柰酚對照品(批號：C26J8Y38642)、山柰素對照品(批號S24N7D25625)、杧果苷對照品(批號Y26M8H36926)均購于上海源葉科技有限公司，阿魏酸對照品(批號：588)，購于上海詩丹德有限公司、蘆丁對照品(批號：MUST-14102301)，購于成都曼斯特生物技術(shù)有限公司.

1.1.3 器材

CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋公司產(chǎn)品)，生物安全柜(濟南鑫貝西公司產(chǎn)品)，離心機(賀立氏臺式低溫離心機)，酶標儀(Thermo公司產(chǎn)品)，MC酒精計(0%～100%)，UltiMate3000超高相液相色譜儀(美國，Thermo Scientific)，四級桿——靜電場軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀、Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo R高速離心機(QExactive TMhybrid quadrupole-Orbitrap mass spectromete，美國，Thermo Scientific)，KQ5200DB超聲波清洗儀、HH-4恒溫水浴鍋(常州博遠實驗分析儀器廠).甲醇、乙腈均為色譜純，乙醇、甲酸為分析純，屈臣氏水.D101大孔吸附樹脂柱.

1.2 實驗方法

1.2.1 制備受試藥物

質(zhì)量50 g的石韋粉碎后，用6倍量水回流提取2次，每次1 h，各合并后過濾，濃縮得到水提取物.水提物濃縮至體積50 mL，加入體積分數(shù)為95%的乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇體積分數(shù)達到80%，冷藏靜置12 h后抽濾.將醇沉上清液部位以水溶解，質(zhì)量濃度為0.5 g/mL，用濃度為0.1 mol/L的HCL調(diào)至pH為4，抽濾，濾液上D101大孔吸附樹脂柱，使藥液液面高于樹脂柱上表面2 cm，靜置吸附12 h.然后依次用蒸餾水、體積分數(shù)為10%、30%、50%的乙醇梯度洗脫，流速為4 BV/h,每個梯度洗脫4 BV，洗脫液濃縮干燥，得各梯度洗脫部位.

1.2.2 藥物體外抗病毒試驗[10-12]

(1)制備多孔板內(nèi)單層細胞 將細胞接種96孔板，在37 ℃、體積分數(shù)5% 的CO2中培養(yǎng)，待長成單層，備用.

(2)藥物體外抗HSV-1、RSV 試驗 將受試藥物用細胞維持液做倍比系列稀釋(第1孔10倍，后續(xù)孔2倍)，共12個梯度的質(zhì)量濃度，分別依次加入96孔板內(nèi)的單層vero細胞上(100 μL/孔)，設(shè)細胞對照、病毒對照.除細胞對照外，各孔加100TCID50的病毒體積為50 μL.于37 ℃、體積分數(shù)5% 的CO2中培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察細胞病變，待病毒對照出現(xiàn)90%細胞病變后終止培養(yǎng).

(3)藥物體外抗EV-71試驗 將受試藥物用細胞維持液做倍比系列稀釋(第1孔10倍，后續(xù)孔2倍)，共12個梯度的質(zhì)量濃度，依次加入96孔板內(nèi)的單層RD細胞上(100 μL/孔)，設(shè)細胞對照、病毒對照.除細胞對照外，各孔加100TCID50的EV71病毒50 μL.于37 ℃、體積分數(shù)5% 的CO2中培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察細胞病變，待病毒對照出現(xiàn)90%細胞病變后終止培養(yǎng).

(4)測量吸光度 將96孔板中的培養(yǎng)液輕輕拍出，每孔加入100 μL中性紅溶液，于37 ℃、體積分數(shù)5% 的CO2下反應(yīng)1 h 取出，倒出中性紅溶液，小水流沖洗3～5遍，甩干，每孔加入100 μL脫色液，于37 ℃、體積分數(shù)5% 的CO2放置15 min.用酶標儀在540 nm處測吸光度值(A值).

(5)TI值計算

細胞存活率=(實驗孔的A值-空白孔的A值)/(細胞對照孔A值-空白孔A值)×100%

病變率=1-存活率

細胞比距=(高于50%病變率-50%)/(高于50%病變率-低于50%病變率)

TCID50=Antilg(Ig高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距×稀釋因子對數(shù))

TI=TC50/EC50，當(dāng)TI≥4時，則認為有抗病毒活性，否則無效.

1.2.3 體外抗病毒活性檢測

將上述制備的各部位按照藥物體外抗病毒試驗下測其抗病毒指數(shù)(表1～表4).

表1 各病毒的TCID50Table 1 TCID50 for each virus

表2石韋體積分數(shù)為10%乙醇洗脫部位抗病毒篩選結(jié)果

Table2Antiviralscreeningresultsofaristolochiavolumefractionof10%ethanolelutionsite

病毒ρ(TC50)/(mg·mL-1)ρ(EC50)/(mg·mL-1)TIHSV-12-2.42-4.54.287RSV2-1.62-5.514.929EV-712-1.92-4.14.595

表3石韋體積分數(shù)為30%乙醇洗脫部位抗病毒篩選結(jié)果

Table3Antiviralscreeningresultsofaristolochiavolumefractionof30%ethanolelutionsite

病毒ρ(TC50)/(mg·mL-1)ρ(EC50)/(mg·mL-1)TIHSV-12-1.62-8.7137.187RSV2-1.32-8.2119.428EV-712-0.92-8.9256.000

表4石韋體積分數(shù)為50%乙醇洗脫部位抗病毒篩選結(jié)果

Table4Antiviralscreeningresultsofaristolochiavolumefractionof50%ethanolelutionsite

病毒ρ(TC50)/(mg·mL-1)ρ(EC50)/(mg·mL-1)TIHSV-12-2.72-7.629.857RSV2-3.12-8.234.297EV-712-2.42-8.568.594

1.2.4 HPLC-MS分析抗病毒有效部位的主要成分

石韋的黃酮部位抗病毒活性顯著，具體抗病毒成分需要進一步分析研究.利用HPLC-MS分析石韋有效抗病毒黃酮部位的主要成分，為進一步研究石韋的主要抗病毒成分提供基礎(chǔ).

(1)色譜條件 色譜柱：Thermo-C18柱(Hypersil GOLD aO,100 mm×2.1 mm,1.9 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：45 ℃；進樣溫度：15 ℃；進樣體積5 μL；梯度洗脫，流動相A為水(含體積分數(shù)為0.05%的甲酸)，流動相B為乙腈，洗脫條件見表5.

表5 洗脫條件Table 5 Elution conditions

(2)質(zhì)譜條件 離子源：HESI；采用負離子模式檢測；毛細管電壓：3 500 V，毛細管溫度：300 ℃；鞘氣45，輔氣10；源內(nèi)溫度350 ℃；質(zhì)譜采集范圍：100～1 000 m/z；分辨率：70 000；S-Lens RF Level為55.

(3)供試品溶液的制備 精密稱取石韋用體積分數(shù)為30%的乙醇洗脫的黃酮部位質(zhì)量20 mg 置于體積25 mL容量瓶中，于體積分數(shù)為80%的甲醇中超聲溶解，并定容至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，得供試品溶液.

2 實驗結(jié)果

采用四級桿-靜電場軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀在1.2.4項條件下對石韋用體積分數(shù)30%的乙醇洗脫黃酮部位進行分析，得到相對應(yīng)的全掃描圖(圖1)，同時進行高分辨二級掃描，得到不同化合物的高分辨二級質(zhì)譜信息.對離子流色譜圖和高分辨二級質(zhì)譜碎片進行分析[13-15].

2.1 石韋用體積分數(shù)為30%的乙醇洗脫黃酮部位成分及分析結(jié)果

石韋用體積分數(shù)為30%的乙醇洗脫黃酮部位，共有15種化合物，分別為綠原酸、咖啡酸、異杧果苷、杧果苷、牡荊素、阿魏酸、蘆丁、木樨草苷、槲皮苷、木樨草素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、香葉木素、山柰素(表6).

圖1 石韋總黃酮部位的總離子流圖

Table6Resultsofidentificationanalysisof15componentsinflavonoidselutedbyethanolat30%ofthevolumefractionofaristolochia

峰號t/min選擇離子Exp/(m·z-1)MSCal/(m·z-1)ppm化合物14.05[M-H]-353.087 86191.055 15、151.038 79353.087 810.14綠原酸24.68[M-H]-179.034 04135.043 81179.034 98-5.25咖啡酸35.45[M-H]-421.078 61331.046 42、301.035 68、259.024 69421.077 632.33異杧果苷45.79[M-H]-421.077 91331.046 23、301.035 61、259.024 78421.077 630.66杧果苷57.91[M-H]-431.099 58341.066 53、323.055 45、311.056 61、293.067 50、283.061 58、269.045 04431.098 372.81牡荊素67.95[M-H]-193.050 19178.026 28、149.059 68、134.035 98193.050 63-2.28阿魏酸78.06[M-H]-609.146 97301.034 61、300.027 74、151.002 47609.146 241.20蘆丁88.46[M-H]-447.093 81285.040 83447.093 281.19木樨草苷99.52[M-H]-447.093 60301.034 94、300.028 08、271.024 96、255.029 83、151.002 50447.093 280.72槲皮苷1012.19[M-H]-285.040 83257.045 99、151.002 52、133.028 18、107.012 38285.040 620.74木樨草素1112.25[M-H]-301.035 64273.091 28、179.034 21、151.038 82301.035 380.86槲皮素1213.02[M-H]-285.040 68242.175 96、112.984 09285.040 460.77山柰酚1313.06[M-H]-315.051 45300.027 83、271.024 29、164.010 50、151.002 52、107.012 38315.051 031.33異鼠李素1414.24[M-H]-299.056 82284.034 88、151.002 82、107.013 16299.056 241.94香葉木素1514.80[M-H]-299.056 11113.987 34299.056 24-0.43山柰素

2.2 石韋用體積分數(shù)為30%的乙醇洗脫黃酮部位的成分質(zhì)譜圖

在負離子模式下，1號峰保留時間為4.05 min，m/z 353.087 86[M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)191.055 15、151.038 79等綠原酸典型碎片離子峰，經(jīng)與對照品對比保留時間及質(zhì)譜信息，化合物1鑒定為綠原酸(圖2).

在負離子模式下，2號峰保留時間為4.68 min，m/z 179.034 04 [M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)135.043 81等咖啡酸典型碎片離子峰，經(jīng)與對照品對比保留時間及質(zhì)譜信息，化合物2鑒定為咖啡酸(圖3).

圖2 1號成分二級質(zhì)譜圖

Fig.2 No.1 component secondary mass spectrum

在負離子模式下，3號峰保留時間為5.45 min，m/z 421.078 61 [M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)331.046 42、301.035 68、259.024 69等離子碎片峰，m/z 421.078 61發(fā)生糖鏈裂解失去C3H6O3得到m/z 331.046 42，m/z 421.078 61發(fā)生糖鏈裂解失去C4H8O4得到m/z 301.035 68，m/z 421.078 61脫去葡萄糖得到苷元離子m/z 259.024 69，經(jīng)與對照品對比保留時間及質(zhì)譜信息，化合物3鑒定為異杧果苷(圖4).

圖4 3號成分二級質(zhì)譜圖

在負離子模式下，4號峰保留時間為5.79 min，m/z 421.077 91 [M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)331.046 23、301.035 61、259.024 78等離子碎片峰，與3號峰質(zhì)譜信息無差別，推測化合物4為杧果苷(圖5).

圖5 4號成分二級質(zhì)譜圖

在負離子模式下，5號峰保留時間為7.91 min，m/z 431.099 58 [M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)341.066 53、323.055 45、311.056 61、293.067 50、283.061 58、269.045 04等牡荊素典型碎片離子峰，其中m/z 431.099 58發(fā)生糖鏈裂解失去C3H6O3得到m/z 341.066 53，m/z 431發(fā)生糖鏈裂解失去C4H8O4得到m/z311.056 61，m/z341丟失H2O得到m/z 323.055 45，m/z 311丟失H2O得到m/z 293.067 50，m/z 311丟失CO得到m/z 283.061 58，m/z 431發(fā)生糖鏈裂解連續(xù)失去C3H6O3和C4H8O4得到m/z 269.045 04，因此推測化合物5為牡荊素(圖6).

圖6 5號成分二級質(zhì)譜圖

在負離子模式下，6號峰保留時間為7.95 min，m/z 193.050 19 [M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)178.026 28、149.059 68、134.035 98等阿魏酸典型碎片離子峰，其中m/z 193丟失CH3得到m/z 178.026 28，m/z 193.050 19丟失COOH得到m/z 149.059 68，m/z 149丟失CH3得到m/z 134.035 98，推測化合物6為阿魏酸(圖7).

在負離子模式下，7號峰保留時間為8.06 min，m/z 609.146 97[M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)301.034 61、300.027 74、151.002 47等蘆丁典型碎片離子峰，其中m/z 301.034 61是苷元離子峰，苷元離子失去一個H得到m/z 300.027 74，苷元離子發(fā)生RDA反應(yīng)得到m/z 151.002 47，經(jīng)與對照品對比保留時間及質(zhì)譜信息，化合物7鑒定為蘆丁(圖8).

圖7 6號成分二級質(zhì)譜圖

圖8 7號成分二級質(zhì)譜圖

在負離子模式下，8號峰保留時間為8.46 min，m/z 447.093 81[M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)285.04083離子碎片峰，m/z 285.040 83為苷元離子峰，推測化合物8為木樨草苷(圖9).

在負離子模式下，9號峰保留時間為9.52 min，m/z 447.093 60 [M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)301.034 94、300.028 08、271.024 96、255.029 83、151.002 50等典型槲皮苷碎片離子峰，其中m/z 301.034 94為苷元離子峰，m/z 300.028 08由苷元離子失去一個H產(chǎn)生，m/z 300.028 08失去COH得到271.024 96，m/z 300.028 08失去CO2H得到m/z 255.029 83，苷元發(fā)生RDA反應(yīng)產(chǎn)生m/z 151.002 50，推測化合物9為槲皮苷(圖10).

在負離子模式下，10號峰保留時間為12.19 min，m/z 285.040 83[M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)257.045 99、151.002 52、133.028 18、107.012 38等木樨草素典型碎片離子峰，m/z 257.045 99由苷元離子失去一個H和CO產(chǎn)生，苷元發(fā)生RDA反應(yīng)產(chǎn)生m/z 151.002 52、133.028 18、107.012 38，經(jīng)與對照品對比保留時間及質(zhì)譜信息，化合物10鑒定為木樨草素(圖11).

在負離子模式下，11號峰保留時間為12.25 min，m/z 301.035 064 [M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)273.091 28、179.034 21、151.038 82等槲皮素典型碎片離子峰，m/z 301.035 064脫CO得到m/z 273.091 28，苷元發(fā)生RDA反應(yīng)產(chǎn)生m/z 179.034 21、151.038 82，經(jīng)與對照品對比保留時間及質(zhì)譜信息，化合物11鑒定為槲皮素(圖12).

圖9 8號成分二級質(zhì)譜圖

Fig9 No. 8 component secondary mass spectrum

圖10 9號成分二級質(zhì)譜圖

圖11 10號成分二級質(zhì)譜圖

在負離子模式下，12號峰保留時間為13.02 min，m/z 285.040 68[M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)242.175 96、112.984 09等離子碎片峰，m/z 242.175 96、112.984 09是由m/z 285.040 68發(fā)生C環(huán)裂解生成，經(jīng)與對照品對比保留時間及質(zhì)譜信息，化合物12鑒定為山柰酚(圖13).

圖12 11號成分二級質(zhì)譜圖

Fig.12 No. 11 component secondary mass spectrum

圖13 12號成分二級質(zhì)譜圖

在負離子模式下，13號峰保留時間為13.06 min，m/z 315.05145 [M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)300.027 83、271.024 29、164.010 50、151.002 52、107.012 38等離子碎片峰，m/z 315丟失CH3得到m/z 300.027 83,m/z 300.027 83丟失COH得到m/z 271.024 29，m/z 164.010 50、151.002 52、107.012 38是有m/z 300.027 83發(fā)生C環(huán)裂解生成，化合物13推測為異鼠李素(圖14).

圖14 13號成分二級質(zhì)譜圖

在負離子模式下，14號峰保留時間為14.55 min，m/z 299.056 82 [M-H]-，二級質(zhì)譜圖中發(fā)284.034 88、151.002 82、107.013 16等離子碎片峰，m/z 299.056 82丟失CH3得到m/z 284.034 88，m/z 151.002 82、107.013 16是有m/z 284.034 88發(fā)生C環(huán)裂解生成，化合物14推測為香葉木素(圖15).

圖15 14號成分二級質(zhì)譜圖

在負離子模式下，15號峰保留時間為14.80 min，m/z 299.056 11[M-H]-，二級質(zhì)譜中m/z 599.119 57是[2M-H]-信號峰，經(jīng)與對照品對比保留時間及質(zhì)譜信息，化合物15鑒定為山柰素(圖16).

圖16 15號成分二級質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

病毒作為一類高度傳染性和變異性的病原體，嚴重危害人類健康[16].本研究通過對石韋采用不同體積分數(shù)乙醇洗脫的黃酮部位進行不同病毒的體外抗病毒實驗，體積分數(shù)為30%的乙醇洗脫的黃酮部位對腸道EV-71病毒抑制效果最好.因此，利用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對體積分數(shù)為30%的乙醇洗脫的石韋黃酮部位進行了鑒定和表征，在負離子檢測模式下利用一級質(zhì)譜獲得黃酮化合物的高質(zhì)量精度準分子離子峰以及相關(guān)碎片離子峰，推斷出黃酮化合物的相對分子質(zhì)量.結(jié)合二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，進一步獲得相關(guān)結(jié)構(gòu)信息，通過分析裂解規(guī)律，參考相關(guān)文獻報道及對照品質(zhì)譜信息鑒定出石韋黃酮部位15個成分，其中3個酚酸類成分，12個黃酮類成分.

EV-71為目前腸病毒群中最晚發(fā)現(xiàn)的病毒，其感染性強且致病率高，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)方面的并發(fā)癥.由于EV-71對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)有極高的感染性，故臨床上出現(xiàn)之癥狀包括腦炎、無菌性腦膜炎、急性無力肢體麻痹、手足口癥、皰疹性咽峽炎、急性出血性結(jié)膜炎、肌肉僵直、頭痛、發(fā)燒及嘔吐等，而其中以手足口癥及泡疹性咽峽炎最為常見.一般而言，感染腸病毒多為無癥狀(約50%～80%)或出現(xiàn)輕微類似感冒的癥狀，病人會自然痊愈而產(chǎn)生抗體，但因感染腸病毒且轉(zhuǎn)成重癥之患者卻有極高的機率死于心肺衰竭及廣泛性的腦干傷害，實不容小覷[17].長期服用西藥，不僅副作用和毒性較大，而且易使病毒產(chǎn)生耐藥性，不易治療.中藥治療具有靶點多，療效好及毒副作用低等優(yōu)勢，從中藥中提取抗病毒成分已經(jīng)成為抗病毒研究的新策略之一.

目前對石韋的藥理作用研究大多致力于抗氧化的研究，本研究通過對石韋黃酮部位進行抗病毒活性追蹤和篩選，以尋求石韋新的藥理作用發(fā)現(xiàn).在接下來的研究將會進一步確定石韋黃酮部位的主要有效抗病毒成分和含量測定以及抗病毒機理.