李 杰 杭柏林董萌萌 寧春妹 司素錦 胡建和

（1河南省新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

大腸桿菌是革蘭氏陰性細(xì)菌的典型代表，是人與動(dòng)物及環(huán)境中的常見細(xì)菌[1-2]。某些致病性大腸桿菌菌株可導(dǎo)致宿主的疾病[3]。某些血清型的大腸桿菌可致仔豬的黃痢、白痢和水腫病[4-5]。使用抗生素是治療和預(yù)防豬大腸桿菌病的常用措施。而在實(shí)際生產(chǎn)中，抗生素的濫用或不正確使用常常導(dǎo)致大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性或超級(jí)細(xì)菌[6-8]。耐藥菌的出現(xiàn)給大腸桿菌病的治療和預(yù)防帶來了極大挑戰(zhàn)。因此，必須及時(shí)關(guān)注豬體內(nèi)大腸桿菌的耐藥性情況，以期為豬大腸桿菌病的治療和預(yù)防提供參考。本試驗(yàn)從腹瀉豬體內(nèi)分離、鑒定到一株耐21種抗生素的大腸桿菌，為豬大腸桿菌病的預(yù)防和治療奠定了基礎(chǔ)，也提出了挑戰(zhàn)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2017年，5份糞便樣本采集自河南省南陽市某豬場(chǎng)腹瀉豬的十二指腸，4℃保存。

1.2 試劑與儀器

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、伊紅美蘭（EMB）瓊脂、麥康凱（Maconkey）瓊脂購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，胰酶解酪蛋白大豆肉湯（TSB）購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。綿羊血和革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。抗菌藥物藥敏紙片及細(xì)菌微量生化反應(yīng)管均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。HBI腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定條購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。2×Taq PCR Master Mix、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒以及DNA純化回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。瓊脂糖購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。pMD19-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，大腸桿菌DH5a為本實(shí)驗(yàn)室自行保存。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為DHP-9082），購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌器（型號(hào)為L(zhǎng)DFF-75KB），購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái)（型號(hào)為SW-CJ-2F），購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；PCR儀（型號(hào)為T-Gradient Thermoblock），購(gòu)自德國(guó)Sartocon公司；電泳儀（型號(hào)為DYY-6C），購(gòu)自北京市六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)為Universal Hood II），購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；高速離心機(jī)（型號(hào)為D-37620），購(gòu)自美國(guó)熱電公司；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)為BA310Digital），購(gòu)自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

用滅菌的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2）將糞便樣品稀釋100倍。將50 μL稀釋液加入含有普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并用“L”型玻璃推棒涂布均勻。將接種后的培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約18～24 h。挑取可疑菌落在新培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線接種。如此操作，分離和傳代，革蘭氏染色后判定細(xì)菌純度。將分離的細(xì)菌與EMB瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和胰酶解酪蛋白大豆肉湯（TSB）一起培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)特征。

1.4 染色和形態(tài)觀察

用革蘭氏染色法和美蘭染色法[5]對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行染色，用光學(xué)顯微鏡（BA310Digital，Motic）觀察分離細(xì)菌形態(tài)，并拍照。

1.5 生理生化特性

按照生化發(fā)酵管和HBI生化鑒定條的說明書進(jìn)行細(xì)菌生理生化試驗(yàn)。細(xì)菌在TSB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)18～24 h，再在TSB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)3 h。將新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌接種入生化發(fā)酵管和生化鑒定條中，置于37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 16S rRNA PCR擴(kuò)增與測(cè)序

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離菌株的DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。采用通用引物擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA基因。引物的序列為：8f：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 和 1492r：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’，預(yù)期片段大小為1 492bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴(kuò)增體系 （50 μL）：Rnase-free H2O 21 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各 1 μL，DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并使用DNA純化回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中，將重組菌液送上海生工有限公司測(cè)序。

1.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將測(cè)序所得基因序列與GenBank公布的各株大腸桿菌16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用DNAStar軟件中Jotun Hein方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8 藥敏試驗(yàn)

按照藥敏紙片說明書進(jìn)行分離細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)。取100 μL對(duì)數(shù)期的分離細(xì)菌(1×108CFU/mL)用“L”型推棒均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，用無菌鑷子貼藥敏紙片于瓊脂表面，37℃培養(yǎng)24 h，參照CLSI（2014）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離結(jié)果

經(jīng)多次分離、傳代，成功從5份豬糞樣本中分離、純化得到1株細(xì)菌。分離細(xì)菌，經(jīng)美蘭染色后，菌體呈藍(lán)色、桿狀(如圖1B)，經(jīng)革蘭氏染色后，菌體呈紅色、桿狀(如圖1A)。這表明，成功從樣本中分離到1株革蘭氏陰性桿菌。

2.2 細(xì)菌的培養(yǎng)特性

將分離的細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如圖2所示。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，分離細(xì)菌長(zhǎng)成圓形、白色的菌落（如圖2A）；在伊紅美蘭瓊脂上，分離細(xì)菌長(zhǎng)成圓形、黑色、帶金屬光澤的菌落（如圖2B）；在綿羊血瓊脂上，分離細(xì)菌長(zhǎng)成圓形、白色的菌落，沒有溶血現(xiàn)象（如圖2C）；在SS瓊脂上，分離細(xì)菌長(zhǎng)成圓形、紅色的菌落（如圖2D）；在麥康凱培養(yǎng)基上，分離細(xì)菌長(zhǎng)成圓形、紅色的菌落（如圖2E）；在TSA液體培養(yǎng)基中，經(jīng)18 h左右的培養(yǎng)，整個(gè)菌液呈均勻渾濁狀（如圖2F）。分離細(xì)菌的培養(yǎng)結(jié)果與大腸桿菌的基本特性相符合。

圖1 細(xì)菌的染色與形態(tài)觀察 （×1 000）

圖2 分離菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性

2.3 細(xì)菌的生理生化結(jié)果

將分離細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。分離細(xì)菌能發(fā)酵甘露醇、麥芽糖、蕈糖、乳糖、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，半固體穿刺、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、吲哚、MR、山梨醇、蜜二糖、棉子糖、七葉苷、乳糖的試驗(yàn)結(jié)果呈陽性，西蒙氏枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素酶、VP、苯丙氨酸、肌醇、核糖醇、水楊素、尿素的試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。參照文獻(xiàn)[10]，符合大腸桿菌的生化特性。

2.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

通過PCR擴(kuò)增分離細(xì)菌的16S rRNA基因序列，結(jié)果符合預(yù)期1 506 bp的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(如圖3)。

圖3 分離細(xì)菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 16S rRNA的同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測(cè)定的分離細(xì)菌的16S rRNA基因序列輸入GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果與大腸桿菌豬肉源 （CP025318株）、犬源 （CP023359株、CP010134株）、人源（CP022407株、CP018948株、CP023349株）的同源性均高達(dá)99.8%。根據(jù)不同屬細(xì)菌16S rRNA基因同源性為70%～90%，而同一種內(nèi)不同株間基因同源性＞99%[11]，結(jié)合上述分離細(xì)菌的染色特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征，可以認(rèn)為分離細(xì)菌為大腸桿菌，暫命名為ZB17090404326。

表1 分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果

通過鄰近法構(gòu)建分離菌株ZB17090404326的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，分離菌株ZB17090404326與豬大腸桿菌CP025753株的親緣關(guān)系最近，所有參與構(gòu)建進(jìn)化樹的大腸桿菌菌株形成2個(gè)主要分支，分離菌株ZB17090404326單獨(dú)形成1個(gè)分支。這表明，分離菌株ZB17090404326是一個(gè)獨(dú)特的大腸桿菌分離株。

圖4 分離菌株的16S rRNA基因序列同源性比較結(jié)果

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將分離菌株ZB17090404326進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出，在測(cè)定的26種藥物中，分離細(xì)菌對(duì)21種藥物耐藥，對(duì)4種藥物敏感。這表明分離菌株ZB17090404326為高耐藥性細(xì)菌。

圖5 分離菌株的16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

細(xì)菌的分離是從細(xì)菌的混合物中獲得某種細(xì)菌的純化物。只有獲得純化細(xì)菌，方可進(jìn)行細(xì)菌的系統(tǒng)性鑒定[12]。而細(xì)菌的鑒定是一項(xiàng)系統(tǒng)工作，常需要檢測(cè)許多項(xiàng)目，如形態(tài)觀察、染色特性、培養(yǎng)特性、生化與生態(tài)特性、血清型鑒定、細(xì)菌毒力測(cè)定、核酸檢測(cè)等。一般講，細(xì)菌鑒定至少需要同時(shí)驗(yàn)證3種指標(biāo)[12]。形態(tài)與染色特性、培養(yǎng)特性和生化特性等的觀察是細(xì)菌鑒定過程中最常用的方法。但現(xiàn)在細(xì)菌鑒定過程中，還常借助細(xì)菌16S核糖體RNA（ribosome RNA，rRNA）的測(cè)定。因?yàn)榧?xì)菌16S rRNA是細(xì)菌進(jìn)化過程中最為保守的基因，是細(xì)菌鑒定時(shí)常用的PCR擴(kuò)增序列[13-14]。細(xì)菌16S rRNA基因可變區(qū)因細(xì)菌不同而異，是細(xì)菌分類的分子基礎(chǔ)，而其保守區(qū)的序列在不同細(xì)菌間基本相同，可反映細(xì)菌間的親緣關(guān)系[15]。因此，通過細(xì)菌16S rRNA基因序列的分析，可對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)了解其演化特征。本研究通過細(xì)菌形態(tài)與染色特性、培養(yǎng)特性和生化特性的觀察，并結(jié)合16S rRNA序列的比對(duì)分析，鑒定從腹瀉豬十二指腸中分離的細(xì)菌為大腸桿菌。

細(xì)菌的耐藥性有單耐藥和多重耐藥。多重耐藥性細(xì)菌對(duì)疾病的預(yù)防和治療提出了挑戰(zhàn)與考驗(yàn)。目前，大腸桿菌的耐藥性以多重耐藥為多見。賀丹丹等[16]對(duì)2011—2012年從患病和健康食品動(dòng)物中分離鑒定到的935株大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物中的大部分藥物的耐藥率超過70%，以耐6～10種抗菌藥物的菌株數(shù)量最多，并有1株大腸桿菌能耐15種抗菌藥物。而在本研究中，分離的大腸桿菌能耐21種抗菌藥物。細(xì)菌的耐藥性主要有固有耐藥和獲得性耐藥[17]。獲得性耐藥是細(xì)菌形成耐藥性的主要原因[18]。而大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生也與長(zhǎng)期使用抗生素有關(guān)[19]。細(xì)菌在抗生素選擇壓力下，為了生存而與抗生素對(duì)抗，通過改變新陳代謝或獲得耐藥性元件，從而形成獲得性耐藥。Collignon等[20]認(rèn)為減少抗生素的使用不足以控制耐藥性，而耐藥菌株和耐藥基因的傳播是耐藥性嚴(yán)重的主要因子。耐藥基因的獲得是細(xì)菌獲得新耐藥特性的重要因素。隨著時(shí)間推移，大腸桿菌的耐藥率越來越高，耐藥譜越來越寬，多重耐藥菌株越來越多[21]。大腸桿菌的耐藥性情況已經(jīng)越來越嚴(yán)峻，對(duì)人類與動(dòng)物的健康造成了巨大威脅[6]。因此，加強(qiáng)大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測(cè)具有重要的公共衛(wèi)生意義。

表2 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果