劉璨穎，陳志勝，林裕鋒，計慧琴，王丙云，陳勝鋒

（佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東佛山 528000）

防御素是一類自然產(chǎn)生的防御分子，具有廣泛的抗細菌、病毒、真菌活性，且病原微生物不易對其產(chǎn)生抗性。防御素的免疫調(diào)控功能日益受到重視，其在炎癥、創(chuàng)傷疾病治療和促進機體生長方面也有一定作用[1-6]。防御素依據(jù)其二硫鍵的位置分為3 個亞類（α-、β-和θ-防御素）[7]。目前，未見α-和θ-防御素在豬中被報道，而在豬中被鑒定的β-防御素有29 種[8-10]。大多數(shù)β-防御素基因有典型的2 個外顯子結構，其中第1 個外顯子編碼疏水性富含亮氨酸信號序列的前肽，第2 個外顯子編碼有活性的成熟多肽。成熟多肽含有6 個穩(wěn)定的半胱氨酸，分別以1-6、2-4、3-5 連接形成3 個分子的二硫鍵，構成穩(wěn)定的反相平行的3 股β- 片層結構[6]。大多數(shù)豬源β-防御素（Porcine β-defensin，pBD）和人源β-防御素（Human β-defensin，hBD）在序列長度和保守性上有很大相似性。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，人源和豬源的防御素基因來源于同一個祖先，不同物種中對應防御素的同源性高于同物種不同防御素的同源性[10]。

在目前的養(yǎng)豬業(yè)中，由抗生素濫用導致的病原微生物耐藥性給畜牧養(yǎng)殖和臨床治療造成了嚴重威脅[11]，急需可以代替抗生素的新型抗病原微生物藥物。β- 防御素作為動物機體天然分泌的小分子活性多肽，具有較好的抗病原微生物活性和免疫調(diào)節(jié)功能。β- 防御素有獨特的抗菌作用機理，使得病原菌不易對其產(chǎn)生耐藥性[9]。因此，pBD 在畜牧養(yǎng)殖和臨床治療中具有替代抗生素的潛能。豬源β- 防御素2（Porcine β-defensin 2，pBD2）和豬源β- 防御素3（Porcine β-defensin 3，pBD3）分別是含有69 和67 個氨基酸的多肽。成熟多肽pBD2 在氨基酸序列上與人源β- 防御素1（Human β-defensin 1，hBD1）有60%的同源性。之前已有關于豬源防御素研究進展的綜述，主要集中于pBD 的分子結構、體內(nèi)分布、抗菌機制和表達方法的研究[9,12-14]。本文綜述了近些年pBD2 和pBD3 表達調(diào)控的相關因素、參與調(diào)節(jié)的信號通路、在生殖發(fā)育中的新功能和在畜牧養(yǎng)殖中的應用，闡述其發(fā)揮生物活性的機制和潛在的應用價值，并對今后pBD2 和pBD3 的研究方向進行展望。

1 pBD 的表達和調(diào)控

1.1 pBD 在體內(nèi)的表達特性 豬源β- 防御素在體內(nèi)的表達具有種類差異性，也有組織特異性和品種差異性。例如，pBD2 和pBD3 均在骨髓及其他淋巴組織中表達，包括胸腺、脾、淋巴結、卵巢、十二指腸和肝臟；除此之外，pBD2 也在舌、腎臟和大腸中表達，而pBD123、pBD125 和pBD129 主要在雄性生殖組織中表達[8,15]。pBD3 表達量最高的組織是舌和口腔黏膜，而pBD2 表達量最高的組織是腎臟和肝臟。pBD3 基因在藏豬大部分組織中的mRNA 表達量高于杜×長×大雜交豬，而pBD2 基因在杜×長×大雜交豬大部分組織中的mRNA 表達量高于藏豬[16]。在抗病力較強的地方豬種梅山豬的小腸黏膜、舌、口腔黏膜和生殖道黏膜等與外界接觸的多個組織中，pBD2 和pBD3 的表達水平均高于杜×長×大雜交豬[17-18]。

1.2 pBD 的表達調(diào)控 pBD 的表達還受發(fā)育階段調(diào)控，且不同種類防御素的表達調(diào)控模式不同。雖然pBD2 和pBD3 都在豬卵泡顆粒細胞中表達，但pBD2 的mRNA表達水平與卵泡發(fā)育階段有關，其在小卵泡顆粒細胞中表達量最高，隨著卵泡發(fā)育，其在大卵泡顆粒細胞中的表達水平逐漸降低；而pBD3 在大卵泡和小卵泡顆粒細胞中的mRNA 表達水平?jīng)]有顯著差異[18]。在仔豬空腸中，pBD2 基因的mRNA 表達水平在斷奶后（出生35 d）較出生21 d 顯著升高，可能是因為斷奶破壞了腸道完整性，微生物入侵刺激了腸上皮分泌防御素[20]。pBD115 在2周齡豬的睪丸中表達水平較高，而在5 月齡豬的睪丸中不表達[8]。

pBD2 與pBD3 在體內(nèi)外的表達水平受外源病原微生物、營養(yǎng)應激、炎性誘導介質(zhì)、膳食化合物中短鏈脂肪酸及其類似物、維生素、Zn2+和L-異亮氨酸等調(diào)節(jié)[18-19,21-23]。在1×108CFU/mL 羅伊氏乳桿菌I5007 作用6 h 下，豬小腸上皮細胞系IPEC-J2 中pBD2 和pBD3 表達量增高，口服1×1010CFU 羅伊氏乳桿菌I5007 能提高新生仔豬空腸中pBD2 和結腸中pBD2 與pBD3 的表達量[24]。膳食化合物中短鏈脂肪酸（如組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c）能提高豬腎臟細胞PK-15 中pBD3 的mRNA 表達水平，但另一種組蛋白去乙?；敢种苿┣帕夭荒苷{(diào)節(jié)pBD3 的表達水平，這可能與組蛋白去乙?；敢种苿┯胁煌淖饔冒悬c有關[25]。在IPEC-J2 中也證實含有3～8個碳原子的短鏈脂肪酸對pBD2 和pBD3 基因的mRNA表達有較為顯著的誘導作用，其中8～16 mmol/L 丁酸鹽的誘導效果較好，丁酸鹽的類似物甘油三丁酸酯、丁酸芐酯和4-苯基丁酸鈉鹽也有相似的誘導作用[21]。此外，在IPEC-J2 細 胞系 中，25 μmol/mL 或100 μmol/mL 硫酸鋅和50 μg/mL 異亮氨酸也能提高pBD2 和pBD3 的mRNA 和蛋白表達水平[22]。營養(yǎng)元素中維生素A、D、E 均能夠不同程度地誘導IPEC-J2 細胞pBD2 或pBD3基因的表達并促進其蛋白的分泌，其中，0.5～20 μmol/L 維生素A 的誘導效果最好。以杜×長×大雜交豬和榮昌豬為動物模型的體內(nèi)實驗結果顯示，飼喂含2～200 IU/kg維生素A 日糧的實驗組中，舌、口腔黏膜、小腸黏膜和肺等組織中內(nèi)源性pBD2 和pBD3 的表達水平均有顯著提高[17]。異亮氨酸、精氨酸和Zn2+處理IPEC-J2 細胞會使其pBD2 和pBD3 基因表達上調(diào)，而饑餓營養(yǎng)基處理會下調(diào)pBD 表達[16,22]。

1.3 pBD2 和pBD3 參與調(diào)節(jié)的信號通路 pBD2 和pBD3 參與調(diào)節(jié)的信號通路包括有絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）、沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關酶1（Sirtuin1，Sirt1）、叉頭轉(zhuǎn)錄因子（Forkhead box O，F(xiàn)oxO）、核 因 子-κB（Nuclear Factor κB，NF-κB）和Toll-樣受體2（Toll-like Receptor-2，TLR2）信號通路等。TLR2 的激活能直接調(diào)節(jié)pBD3 的表達，外源肽聚糖能激活TLR2，TLR2 沉默的PK-15 細胞在受到肽聚糖刺激后pBD3 表達減少[25]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉對pBD3 的誘導表達與NF-κB 信號通路的激活有關[25]。營養(yǎng)應激和氨基酸對IPEC-J2 細胞中pBD2 和pBD3 表達的調(diào)控與Sirt1、FoxO 和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）信號通路可能有關，應激和營養(yǎng)物質(zhì)可通過FoxO 依賴通路調(diào)節(jié)Sirt1，而Sirt1 可直接影響防御素的表達[23,26-27]；異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸對pBD 的誘導表達可能與ERK1/2 的磷酸化有關[28]。pBD3 對豬源大卵泡顆粒細胞增殖和遷移的促進作用可能與激活MAPK- ERK1/2信號通路有關[29]。

2 豬源pBD2 和pBD3 的功能機制研究

2.1 pBD2 和pBD3 在抗菌方面的作用 防御素通過多種機制發(fā)揮抗病原微生物活性，其中包括阻止細胞壁生物合成、抑制生物膜形成、對外周的細胞壁穿孔，通過自身的正電荷殘基與細菌細胞膜表面脂多糖或磷脂分子的陰離子電荷互作從而中和外毒素，或者增加細菌細胞壁的通透性，進入細菌直接靶向DNA 或RNA 而殺死細菌[30-32]。在豬源防御素中，pBD2 是研究較多的防御素；pBD2 對包括多耐藥性菌株在內(nèi)的革蘭氏陰性和陽性菌都有較好的抑菌效果；4～8 μmol/L pBD2 能在3 h 內(nèi)殺死鼠傷寒沙門氏桿菌、李斯特氏菌和紅斑丹毒絲菌[33]，且超表達pBD2 的轉(zhuǎn)基因豬對常見的呼吸系統(tǒng)病原菌胸膜肺炎放線桿菌的抵抗力增強[34]。此外，豬防御素和抗生素還有協(xié)同抑菌效果[35]。為了研究防御素正電荷殘基與其抗菌能力的關系，有研究者對成熟pBD2 多肽（含有37 個氨基酸）中的8 個氨基酸位點分別進行單位點突變；在不影響pBD2 二級結構的前提下，用中性或堿性氨基酸代替酸性氨基酸來增加多肽的凈正電荷，檢測pBD2 突變體的抗菌活性[36]。該研究結果顯示，具有最高正電荷的pBD2 突變體并沒有顯示出最強的抗菌活性，pBD2 突變體中僅有I4R 的抗菌活性較高；證實pBD2 的抗菌活性不僅與其正電荷殘基有關，可能還與其正電荷殘基在分子表面的排列、與其正電荷殘基對分子和結構穩(wěn)定性的作用等有關[36]。pBD2 突變體I4R不僅有更強的抗菌活性，而且其抗菌活性更持久，對豬紅細胞的毒性低、溶血作用小，因此I4R 可能具有較好的臨床應用價值[36]。

2.2 pBD2 和pBD3 在促進生長和抑制炎癥方面的作用有研究證實pBD2 能促進仔豬生長，具有替代抗生素的潛力[37-39]。每千克基礎日糧中添加5 g pBD2 可提高斷奶仔豬的體重、平均日增重量和平均日采食量，降低仔豬斷奶后腹瀉發(fā)生率，能和益生菌一樣影響腸道形態(tài)學指標，提高盲腸食糜中益生菌的拷貝數(shù)，減少病原菌[37-38]。飼喂防御素能夠明顯改善母豬體況，提高仔豬成活率和健康水平，從而提高養(yǎng)豬效益。妊娠母豬日糧中添加2 g/kg 基因工程防御素可提高仔豬出生成活率，降低弱仔率、死胎率、發(fā)病率和死亡率[39]。保育豬飼喂防御素后發(fā)病率和死亡率也得到降低[39]。此外，pBD2 能降低硫酸葡聚糖鈉鹽誘導的小鼠結腸炎癥與黏膜病變；pBD2 可能通過上調(diào)與緊密連接和黏蛋白相關蛋白基因（包括閉鎖小帶蛋白1、2，緊密連接蛋白1，黏液素1 和2）的表達，抑制硫酸葡聚糖鈉鹽誘導的炎癥，通過抑制誘導型一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶和細胞凋亡來發(fā)揮作用。pBD2 直腸內(nèi)給藥可能作為潰瘍性結腸炎的一種新型預防措施[40]。

2.3 pBD2 和pBD3 在生殖方面的作用 近期有研究顯示，部分pBD 與雄性動物精子的運動能力以及雌性動物卵泡發(fā)育有關[29,41]。5 μmol/L pBD1 和pBD2 能降低精子的運動能力，3 μmol/L pBD1 和pBD2 雖對精子活力無影響，但有較好的抑菌作用，因此3 μmol/L 的pBD1 和pBD2 可以用作豬精液貯液中的抗生素替代物[41]。pBD3能顯著提高小卵泡顆粒細胞的增殖與遷移能力，且其增殖促進作用可能與pBD3 顯著提高小卵泡顆粒細胞中增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）和細胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）編碼基因的mRNA 水平有關，而pBD2 對卵泡顆粒細胞的增殖無顯著作用，50 μg/mL pBD2 還會抑制大卵泡顆粒細胞的遷移作用[29]。

2.4 hBD3 在臨床應用中的研究 pBD 與hBD 在氨基酸序列上有一定的同源性。在臨床應用研究中證實，hBD3 可以通過抑制巨噬細胞中的免疫反應而控制牙周炎的發(fā)展[42]，可以減輕由鼠傷寒沙門氏菌調(diào)節(jié)因子表達和增強糞腸球菌活性而引起的腸損傷[43]。hBD3 作為佐劑，還能顯著提高金黃色葡萄球菌滅活疫苗的免疫效果[44]。hBD3 可以在轉(zhuǎn)基因牛腺體中表達，并對致乳腺炎的病原菌有抑制作用[45]。對hBD3 功能片段的研究中發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列C 末端15 個氨基酸構成的小肽仍具有與hBD3 相當?shù)挠行Э咕钚?、皮膚和細胞滲透活性，且該片段能夠抑制脂多糖誘導的誘導型一氧化氮、一氧化氮合酶和細胞因子的產(chǎn)生，能作為治療免疫疾病時的藥物載體[46]。hBD3 的γ 核心片段（EEQIGKSSTRGRKCCRRKK）具有hBD3 最重要的生物學特性，對人類免疫缺陷病毒和單純皰疹病毒有抗病毒活性[46]。此外，hBD3 的衍生物CHRG01 僅含有14 個氨基酸（KSSTRGRKSSRRKK）的多肽，也能滲透細菌的外膜而具有殺菌作用[48]。

3 小結與展望

pBD 除了具有較好的抗病原微生物活性和免疫調(diào)節(jié)功能外，對動物腸道內(nèi)固有益生菌和細胞危害小，對動物機體生長和生殖發(fā)育也有一定的促進作用。因此，pBD 在畜牧養(yǎng)殖和臨床治療中具有替代抗生素的潛能，在畜牧養(yǎng)殖中可作為飼料添加劑使用。且在體外表達pBD 方面，有研究證實pBD2 在工程菌畢赤酵母中能大量高效表達，且能耐受高溫、極端pH 和部分有機溶劑[49]，這為體外大量表達pBD 應用于畜牧養(yǎng)殖和臨床治療中提供了理論基礎。但目前關于pBD 的研究遠遠落后于hBD，因此今后還需要不斷挖掘pBD2 和pBD3 在畜牧養(yǎng)殖和疾病治療中的應用價值，對其功能片段進行探究，該活性多肽將有望應用于臨床，為多種疾病的治療提供新手段。