李皓 李仁嵩 肖志剛 陳森

(武漢市武昌醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430063)

骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨退變，累及包括滑膜、軟骨、軟骨下骨、韌帶、半月板等整個(gè)關(guān)節(jié)的慢性退行性疾病。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制目前為止尚無定論，但可以肯定的是：骨關(guān)節(jié)炎是多因素共同作用的結(jié)果。研究證實(shí)：骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞存在過度凋亡，相反，抑制軟骨細(xì)胞凋亡可延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展〔1〕。因此，軟骨細(xì)胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)。京尼平苷具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如抗炎鎮(zhèn)痛和抗細(xì)胞凋亡。有研究表明，京尼平苷可以保護(hù)硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制尚未完全揭示〔2〕。本研究旨在探討京尼平苷對(duì)SNP誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞凋亡及骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)大鼠：取8周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，由武昌醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心供給〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0004〕，雌雄不限。實(shí)驗(yàn)過程符合2006版《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的標(biāo)準(zhǔn)。

主要試劑：京尼平苷(上海純優(yōu)生物有限公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(武漢博士德生物公司)；杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基(DMEM)/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；SNP(華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司)；Cell counting kit-8(CCK-8)試劑盒(日本Dojindo公司)；D-Hank平衡液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量測定試劑盒(北京普利萊生物有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒(武漢博士德生物公司)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)；Hoechst34580試劑盒(日本Dojindo公司)；羅丹明(Rho)123染液(日本Dojindo公司)；4%多聚甲醛溶液(武漢博士德生物公司)；其他常用試劑為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1軟骨細(xì)胞的提取及培養(yǎng) 取8周齡的SPF級(jí)SD大鼠,頸椎脫臼處死后，游離膝關(guān)節(jié)，75%酒精浸泡10 min；無菌條件下帶入超凈工作臺(tái)，初步游離雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，無菌紗布去除周圍軟組織，將軟骨置于金屬器皿中；用11號(hào)手術(shù)刀片將其切成約1.0 mm3大小，置入5 ml無菌離心管中，往離心管中加1∶5體積比的胰酶，置于恒溫?fù)u床中(溫度37℃，轉(zhuǎn)速100 r/min)60 min，然后1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入1∶5體積比的0.25%Ⅱ型膠原酶，置于恒溫?fù)u床中(溫度37℃，轉(zhuǎn)速100 r/min)180 min，1 000 r/min離心5 min；離心后棄上清，加2 ml含有10%胎牛血清(FBS)、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基,將其混勻；20目尼龍網(wǎng)篩過濾，吸出后加入培養(yǎng)瓶中，再加培養(yǎng)基至5 ml，倒置顯微鏡下觀察可見軟骨細(xì)胞。

1.2.2SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型的建立 取第二代軟骨細(xì)胞，用0.02%EDTA(含0.25%胰蛋白酶)消化液消化，制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋；將稀釋后的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱(含5%CO2)內(nèi)培養(yǎng)，次日換液；當(dāng)軟骨細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板80%左右時(shí)，用含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基再次換液，同時(shí)加入SNP溶液，設(shè)對(duì)照組、SNP終濃度0.75、1.00、1.50、2.00 mmol/L 5組細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)24 h；光鏡下觀察軟骨細(xì)胞凋亡情況，保存圖片，記錄SNP誘導(dǎo)凋亡的最適終濃度(據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為1.00 mmol/L)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考。

1.2.3CCK-8細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 選取狀態(tài)良好的二代軟骨細(xì)胞，消化液將細(xì)胞制成懸液，離心5 min(1 000 r/min)；倒掉上清液，加入DMEM/F12(含10%FBS)培養(yǎng)基；細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，按濃度稀釋，將細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度種于96孔板(每孔100 μl)，軟骨細(xì)胞貼壁后，饑餓法(無血清培養(yǎng)基)培養(yǎng)24 h；加入京尼平苷，終濃度分別為20、40、80、160 μg/L，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。對(duì)照組加入等量PBS；每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。96孔板中，每孔滴入CCK-8溶液10 μl，1 h后酶標(biāo)儀檢測吸光度A值。計(jì)算方法參照酶標(biāo)儀說明書，即：細(xì)胞活力(%)=(待測組-空白組)/(標(biāo)準(zhǔn)組-空白組)×100%，重復(fù)3次。

1.2.4Hoechst34580觀察細(xì)胞核形態(tài) 實(shí)驗(yàn)分四組，對(duì)照組、1 mmol/L SNP組、80 μg/L京尼平苷組，160 μg/L京尼平苷組，兩個(gè)濃度京尼平苷組也分別加用1.0 mmol/L SNP。將含4組細(xì)胞的6孔板置于37℃培養(yǎng)箱(含5%CO2)中避光培養(yǎng)24 h；棄上清，PBS洗滌3次，固定30 min(4%多聚甲醛固定液)；小心倒掉固定液，PBS 2 ml洗滌細(xì)胞3次，每次5 min；加Hoechst34580染液500 μl(終濃度為5 μg/ml)，37℃避光孵育30 min；棄Hoechst34580染液，加入2 ml PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min；倒置熒光顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞核形態(tài)(激發(fā)波長355 nm、發(fā)射波長465 nm)。

1.2.5Rho123檢測線粒體膜電位 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4。棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加入2 ml DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基；將6孔板置于37℃培養(yǎng)箱(含5%CO2)中避光培養(yǎng)；滴加Rho123染液，調(diào)整終濃度至10 μmol/L，37℃避光放置30 min；棄Rho123染液，加入2 ml PBS緩沖液洗滌6孔板細(xì)胞2次，每次5 min；倒置熒光顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞，Rho123染色陽性細(xì)胞顯示綠色熒光(激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm)。

1.2.6流式細(xì)胞檢儀檢測細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4。將含4組細(xì)胞的6孔板置于37℃培養(yǎng)箱(含5%CO2)中培養(yǎng)。24 h，錫紙包裹，避面曝光；將每孔上清液收集，再用0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶)消化并收集細(xì)胞懸液；1 000 r/min離心5 min，收集上清，加入預(yù)冷PBS稀釋細(xì)胞，收集細(xì)胞；將每孔所有液體混合，1 000 r/min離心5 min，加入凋亡檢測試劑盒內(nèi)的結(jié)合緩沖液500 μl于離心收集的細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞懸液輕輕混勻，至于冰上放置30 min；分別加5 μl AnnexinV-FITC和10 μl PI，室溫避光孵育5 min；樣本上機(jī)檢測，記錄保存相關(guān)結(jié)果。

1.2.7Western印跡 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4。分別調(diào)好終濃度，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書，將試劑盒中A液和B液按1∶50的比例充分混勻后配成工作液；取10 μl經(jīng)三蒸水溶解的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋至100 μl使其終濃度達(dá)到0.5 mg/ml。再將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、16、20 μl的量分別加入到酶標(biāo)板上，然后用三蒸水把各個(gè)孔補(bǔ)足到20 μl；再在各個(gè)孔中加入200 μl前面配好的工作液，37℃恒溫烤箱中放置40 min后使用酶標(biāo)儀測定565 nm波長處的吸光度OD值。根據(jù)前面所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。然后用裂解液將各個(gè)蛋白樣品的濃度調(diào)成一致。使用電化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光試劑，在室溫下孵育PVDF膜后放入暗盒中，暗室紅燈下曝光1 min，然后顯影，定影；對(duì)膠片進(jìn)行拍照，再用軟件分析條帶的灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行單因素方差分析，Graphpad Prism5軟件行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡 SNP終濃度0.75 mmol/L組見少量細(xì)胞死亡；1.00 mmol/L組死亡約40%；1.50 mmol/L組死亡約50%；2.00 mmol/L組死亡約80%。死亡過多，對(duì)細(xì)胞的檢測及蛋白的測量均有影響；死亡過少，不能體現(xiàn)組間差異，因此，誘導(dǎo)凋亡的適宜濃度為1.00 mmol/L。見圖1。

2.2不同濃度京尼平苷對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響 對(duì)照組存活率(100±1)%，20 μg/L京尼平苷組為(98±3)%，40 μg/L組為(97±5)%，80 μg/L組為(99±4)%，160 μg/L組為(96±2)%，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明不同濃度京尼平苷對(duì)軟骨細(xì)胞增殖抑制效果不明顯。

2.3京尼平苷對(duì)SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡細(xì)胞核形態(tài)的影響 對(duì)照組軟骨細(xì)胞核均染，核圓，無固縮及裂解；經(jīng)1 mmol/L SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞數(shù)目明顯減少，可見核固縮與核碎裂的細(xì)胞，偶見凋亡小體；經(jīng)80 μg/L京尼平苷作用的SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞核固縮、核碎裂與1 mmol/L SNP組比較有所降低；經(jīng)160 μg/L京尼平苷作用的SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞核固縮與核碎裂細(xì)胞數(shù)量有所減少，核固縮與核碎裂與1 mmol/L SNP組及80 μg/L京尼平苷組比較有所降低。由此可見京尼平苷對(duì)SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡有一定保護(hù)作用。見圖2。

2.4京尼平苷對(duì)SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡細(xì)胞線粒體膜電位的影響 對(duì)照組軟骨細(xì)胞線粒體染色為綠色熒光，清晰、明亮，表明線粒體膜電位正常；1 mmol/L SNP組軟骨細(xì)胞線粒體染色細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明線粒體膜電位明顯降低，膜完整性受到破壞；80 μg/L京尼平苷組軟骨細(xì)胞線粒體染色綠色熒光強(qiáng)度較1 mmol/L SNP組強(qiáng)；160 μg/L京尼平苷組軟骨細(xì)胞線粒體染色綠色熒光強(qiáng)度較1 mmol/L SNP組及80 μg/L京尼平苷組強(qiáng)，但較對(duì)照組軟骨細(xì)胞熒光強(qiáng)度差，表明線粒體膜電位損傷明顯恢復(fù)。見圖3。

圖1 不同濃度SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡(×100)

圖2 京尼平苷對(duì)SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡細(xì)胞核形態(tài)的影響(×100)

圖3 京尼平苷對(duì)SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡細(xì)胞線粒體膜電位的影響(×100)

2.5京尼平苷對(duì)SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的影響 1 mmol/L SNP組凋亡明顯〔凋亡率(49.32±4.23)%〕；80 μg/L京尼平苷組軟骨細(xì)胞凋亡次之〔凋亡率(27.97±4.35)%〕；160 μmol/L京尼平苷組軟骨細(xì)胞凋亡〔凋亡率(22.92±5.24)%〕較1 mmol/L SNP組及80 μg/L京尼平苷組少，但仍高于對(duì)照組〔凋亡率(7.52±1.01)%〕，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，4組細(xì)胞凋亡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6各組軟骨細(xì)胞內(nèi)iNOS、Bax蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組細(xì)胞很少表達(dá)iNOS、Bax蛋白；1 mmol/L SNP組iNOS、Bax蛋白表達(dá)最明顯(P<0.05)；80 μg/L京尼平苷組iNOS、Bax蛋白表達(dá)較1 mmol/L SNP組低(P<0.05)，但高于80 μg/L京尼平苷組(P<0.05)。見圖4，表1。

圖4 京尼平苷對(duì)SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡軟骨細(xì)胞內(nèi)iNOS、Bax蛋白表達(dá)的影響

表1 不同組間iNOS和Bax的表達(dá)情況

與1 mmol/L SNP組比較：1)P<0.05；與80 μg/L京尼平苷組比較：2)P<0.05

3 討 論

提取軟骨細(xì)胞的常用方法包括組織塊法、酶消化法。本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法從8周齡SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中分離出細(xì)胞，經(jīng)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原免疫組化的方法證實(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。對(duì)于體外軟骨細(xì)胞凋亡模型的建立，不同藥物、不同濃度的誘導(dǎo)方法均有報(bào)道〔3〕。本研究采用終濃度為1 mmol/L的SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，效果明顯，符合實(shí)驗(yàn)要求。用SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的文獻(xiàn)并不少，且誘導(dǎo)凋亡的SNP終濃度報(bào)道不一致〔4〕。其原因可能為：(1)不同研究者對(duì)凋亡的需求程度不同，例如半數(shù)致死濃度和75%致死濃度肯定存在差異。(2)不同實(shí)驗(yàn)室、不同研究人員體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞存在差異。但SNP構(gòu)建體外軟骨細(xì)胞凋亡模型，效果明顯是大家的共識(shí)。軟骨細(xì)胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎之間關(guān)系十分密切。骨關(guān)節(jié)炎軟骨中軟骨細(xì)胞凋亡率明顯高于正常關(guān)節(jié)軟骨，骨關(guān)節(jié)炎累及區(qū)域軟骨細(xì)胞凋亡也高于非累及區(qū)域，軟骨細(xì)胞凋亡的分布區(qū)域與荷載區(qū)域相關(guān)。軟骨起緩沖作用，最先累及淺層或淺中層，因此，淺層或淺中層軟骨細(xì)胞較深層凋亡明顯。以上跡象表明，軟骨細(xì)胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎呈時(shí)間、空間相關(guān)。有學(xué)者經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)證實(shí)正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率為4.8%，而關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞凋亡率為22.3%〔5〕；還有研究表明骨關(guān)節(jié)炎軟骨中細(xì)胞凋亡率為4%～14%，而健康人群骨關(guān)節(jié)炎軟骨中細(xì)胞凋亡率不超過2%〔6〕。盡管骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞凋亡率存在差異，不排除不同方法檢測細(xì)胞凋亡的靈敏度和特異度存在差異，也有可能不同物種、不同人群、不同區(qū)域的結(jié)果存在差異。京尼平苷是梔子的主要藥效成分之一，化學(xué)分子量為388.37，屬于環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類物質(zhì)；具有抗炎鎮(zhèn)痛、緩瀉利膽、促軟組織損傷愈合、抗凋亡及抑胃酸分泌等作用。目前治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物主要分為緩解癥狀和改善病情兩大類〔7〕。京尼平苷的多重功效對(duì)骨關(guān)節(jié)炎是否具有治療價(jià)值，是個(gè)值得探索的問題。本研究嘗試將京尼平苷應(yīng)用于體外凋亡的軟骨細(xì)胞，結(jié)果顯示京尼平苷具有抗SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的作用。Bax蛋白具有促凋亡作用，處于凋亡信號(hào)通路的下游〔8〕，其表達(dá)下降意味著細(xì)胞凋亡事件減少。iNOS表達(dá)下降意味著通過PI3K-Akt信號(hào)途徑產(chǎn)生的NO減少，依賴NO的cGMP-PKG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡事件也相應(yīng)減少。一氧化氮合酶分為神經(jīng)元型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和iNOS三種，正常體內(nèi)存在eNOS及nNOS兩種一氧化氮合酶，生理功能各異，因此稱為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)。這兩者的活性受細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)〔9〕。iNOS一般不表達(dá)，但在某些藥物或細(xì)胞因子的刺激下可以促使其表達(dá)。一旦iNOS表達(dá)，因其活性為非Ca2+離子依賴性，故可持續(xù)表達(dá)。iNOS的持續(xù)表達(dá)可使NO水平升高，促使各種細(xì)胞因子分泌，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的基因表達(dá)及其活性，抑制膠原蛋白的合成、促進(jìn)膠原蛋白的分解及影響軟骨的營養(yǎng)交換從而損害軟骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)〔10～12〕。本研究中京尼平苷使SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的軟骨細(xì)胞內(nèi)iNOS蛋白水平下降，似乎可以解釋上述現(xiàn)象。因此，京尼平苷對(duì)SNP誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過降低軟骨細(xì)胞iNOS的表達(dá)，從而達(dá)到抑制軟骨細(xì)胞凋亡的效果。