唐巍巍，熊 可，李 楠，王 爽，于亞君，晏一淇，張 晗

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院生物學(xué)部，天津 301617）

腦卒中是僅次于心肌梗死的第二大死亡病因，也是導(dǎo)致殘疾的主要原因[1]。腦卒中分為缺血性腦卒中（IS）、蛛網(wǎng)膜下腔出血性腦卒中和腦出血性腦卒中3種類(lèi)型，其中80%為IS。IS是一種由腦血流中斷、組織缺血和神經(jīng)細(xì)胞凋亡引起的疾病。糖尿病、高血壓病史、心臟等原因是卒中的危險(xiǎn)因素。中國(guó)每年腦卒中的病死率約為160萬(wàn)[2]，腦卒中治療負(fù)擔(dān)日趨加重。目前，組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）療法是唯一經(jīng)過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認(rèn)證的治療腦卒中的方法[3]。但由于t-PA溶栓治療的時(shí)間窗非常狹窄，并且使用t-PA溶栓后會(huì)出現(xiàn)腦出血、再梗死和再灌注損傷等并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，目前只有31%的腦卒中患者在t-PA溶栓后3～6個(gè)月后康復(fù)[4-6]。因此，想要更多的IS患者受益，就需要研究新的藥物或治療方法來(lái)減輕t-PA溶栓后產(chǎn)生的不良并發(fā)癥或延長(zhǎng)t-PA治療時(shí)間窗。

1 t-PA溶栓機(jī)制及并發(fā)癥產(chǎn)生機(jī)制

1.1 t-PA溶栓機(jī)制 正常情況下，人體內(nèi)凝血和纖溶系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，IS發(fā)生時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡被破壞，t-PA可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的纖溶特性，并通過(guò)酶促反應(yīng)使纖溶蛋白酶原轉(zhuǎn)化為纖溶蛋白，進(jìn)而使交聯(lián)纖維蛋白降解[7]，達(dá)到溶栓的效果。

1.2 t-PA溶栓后并發(fā)癥產(chǎn)生機(jī)制 腦缺血和缺血后再灌注會(huì)導(dǎo)致腦毛細(xì)血管功能障礙，使血腦屏障毛細(xì)血管的通透性發(fā)生改變。缺血引起的毛細(xì)血管通透性改變經(jīng)歷離子性水腫，血管性水腫，出血性轉(zhuǎn)化3個(gè)階段。當(dāng)血腦屏障（BBB）的完整性遭到破壞，BBB不能繼續(xù)維持血管內(nèi)成分的穩(wěn)定，水、鈉離子、血液、血清蛋白等物質(zhì)進(jìn)入大腦，造成腦水腫，這是再灌注損傷和出血性轉(zhuǎn)化（HT）的共同原因。

HT是使用t-PA溶栓療法治療IS后產(chǎn)生的最令人擔(dān)憂(yōu)的神經(jīng)血管并發(fā)癥。其發(fā)病機(jī)制是t-PA能上調(diào)和過(guò)度激活基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)，溶栓后通過(guò)增加MMP-2和MMP-9活性來(lái)增加BBB損傷和缺血性腦出血癥狀的危險(xiǎn)性[8]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族由至少25個(gè)鋅結(jié)合蛋白水解酶家族組成，它們消化細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），在哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起重要的生理作用。其中MMP-2和MMP-9的表達(dá)增加可能導(dǎo)致缺血后潛在的神經(jīng)血管的破壞、腦組織和腦細(xì)胞外基質(zhì)損傷的第一階段。MMP-2和MMP-9的過(guò)表達(dá)使EMC蛋白降解和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和毒素分子進(jìn)入大腦，最終造成大腦損傷。因此MMP-2和MMP-9在增加BBB膜通透性上起到關(guān)鍵的作用。早期的BBB損傷是導(dǎo)致致命的溶栓后出血的主要危險(xiǎn)因素[9]。

t-PA引起的血腦屏障損傷通常可加速腦缺血等疾病的進(jìn)程，增加細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性的癥狀[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腦缺血時(shí)，BBB血管膜蛋白的降解是BBB損傷的主要原因，BBB在新的治療方法中起到關(guān)鍵性的作用。因此，任何以保護(hù)BBB為中心靶點(diǎn)、減少t-PA溶栓后對(duì)BBB損傷的治療方法，均可改善t-PA溶栓治療后產(chǎn)生的細(xì)胞毒性、神經(jīng)毒性和HT癥狀，并且擴(kuò)大t-PA溶栓治療的治療時(shí)間窗[10-11]。

2 t-PA溶栓治療優(yōu)化方法研究進(jìn)展

2.1 優(yōu)化t-PA溶栓療法潛在靶點(diǎn) 小窩蛋白-1（Caveolin-1）是小窩蛋白的主要結(jié)構(gòu)，它在胞吞、囊泡運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到關(guān)鍵的作用。Caveolin-1病理?xiàng)l件下會(huì)通過(guò)阻斷緊密連接蛋白導(dǎo)致BBB損傷[12]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8，13]，t-PA 可以通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞中Caveolin-1的表達(dá)從而提高細(xì)胞外MMP-9水平，敲除Caveolin-1后內(nèi)皮細(xì)胞中MMPs的活力降低。因此，Caveolin-1可能作為IS使用t-PA溶栓后出血性并發(fā)癥的治療靶點(diǎn)。

t-PA+常壓氧（NBO）+EtOH或低溫聯(lián)合使用可明顯降低促凋亡蛋白的表達(dá)和促進(jìn)抗凋亡蛋白表達(dá)從而來(lái)保護(hù)神經(jīng)使神經(jīng)存活[4]。血管生成素樣蛋白4（Angptl-4）是一種分泌蛋白，它是由血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞缺氧缺血損傷產(chǎn)生的[14]。t-PA和Angptl-4聯(lián)合使用可以減少梗死體積，改善神經(jīng)功能障礙，Angptl-4可能通過(guò)防止血液不流通保護(hù)血管從而對(duì)抗急性心肌梗死，它可能成為一個(gè)新的中風(fēng)治療靶點(diǎn)[15-16]。

2.2 t-PA溶栓療法風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè) 血腦屏障是一個(gè)通過(guò)嚴(yán)格調(diào)節(jié)分子、離子和細(xì)胞流量的動(dòng)態(tài)平衡從而保護(hù)腦血管的選擇性屏障。內(nèi)皮細(xì)胞（EC）、細(xì)胞間緊密連接（TJ）、細(xì)胞外基質(zhì)（EMC）是BBB的主要結(jié)構(gòu)成分。EC可以限制跨細(xì)胞和細(xì)胞旁分子的運(yùn)動(dòng)。TJ和EMC是維持BBB完整性的主要組成部分。TJ蛋白主要由閉合蛋白（claudins）和閉鎖蛋白（occludin）構(gòu)成，形成了血腦屏障的第一道屏障[17]。EMC的主要成分為基底膜和間質(zhì)充質(zhì)，它的主要功能為支撐血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管組織。EC、TJ和EMC三者能夠共同維持BBB內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。Occludin是一個(gè)BBB結(jié)構(gòu)中重要的緊密連接蛋白，IS時(shí)Occludin通常會(huì)遭到破壞，從而導(dǎo)致 BBB 損傷[12，18]。研究顯示[9]，血液中Occludin蛋白水平與中風(fēng)早期階段BBB損傷程度有很大的關(guān)系：在大腦中腦動(dòng)脈動(dòng)阻塞（MCAO）發(fā)生前4.5 h由腦缺血引起的Occludin蛋白水平增加具有時(shí)間依賴(lài)性，4.5 h后Occludin蛋白水平急劇增加；腦缺血時(shí)，2個(gè)主要的Occludin蛋白碎片被確認(rèn)。據(jù)實(shí)驗(yàn)證明[19]，Occludin蛋白被MMPs和Caspase-3降解成55kDa和31kDa兩種，其中31kDa蛋白在血液種的水平可反應(yīng)BBB損傷程度；在MCAO發(fā)生的前24 h血液中Occludin蛋白能夠保持明顯高于基礎(chǔ)水平。另有研究表明[20]，由于在無(wú)出血轉(zhuǎn)化的患者循環(huán)血液中Occludin蛋白水平幾乎為0，所以O(shè)ccludin在預(yù)測(cè)患者出血轉(zhuǎn)化上好于claudin-5。由以上可見(jiàn)，Occludin蛋白水平可以作為臨床相關(guān)的生物標(biāo)記來(lái)評(píng)估使用t-PA療法之前患者ICH風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 t-PA溶栓療法并發(fā)癥的改善 膜聯(lián)蛋白Ⅱ（Annexin A2）是plasminogen和其激動(dòng)劑t-PA的細(xì)胞表面受體。在高血糖刺激7 d人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）的實(shí)驗(yàn)中[21]，高血糖可引起Annexin A2功能障礙，從而導(dǎo)致整體細(xì)胞表面纖溶活性降低，當(dāng)加入重組Annexin A2（r-A2）孵育后，高血糖引起的細(xì)胞表面纖溶活性降低癥狀可得到恢復(fù)。另有研究表明[22-23]，r-A2可減少大鼠體內(nèi)頸動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈血栓的形成，由此可見(jiàn)Annexin A2在溶栓過(guò)程中起到重要作用。Annexin A2能與Annexin A2輕鏈（S100A10或P11）、plasminogen和纖維蛋白酶原激動(dòng)劑t-PA形成一個(gè)四聚體[24]。與單獨(dú)使用同樣劑量的t-PA相比，四聚體能夠使plasminogen轉(zhuǎn)化為plasmin的轉(zhuǎn)化率提高60多倍并且可以提高t-PA的藥效[24]。與傳統(tǒng)大劑量使用t-PA相比，r-A2聯(lián)合低劑量t-PA使用可以改善局灶性栓塞腦卒中大鼠的的溶栓再灌注效應(yīng)，明顯促進(jìn)纖溶，減少死亡率、腦梗死、出血性轉(zhuǎn)變，延長(zhǎng)中風(fēng)再灌注治療時(shí)間窗，為腦卒中的預(yù)后治療提供了一種安全、有效的方法，同時(shí)為臨床治療的基礎(chǔ)研究提供了理論依據(jù)[7，25-26]。

激活或抑制蛋白激酶C（PKC）同工酶被認(rèn)為對(duì)缺血后的血管具有保護(hù)作用，PKCε可防止活性氧的生成和細(xì)胞內(nèi)的損傷[27]。PKCα和PKCδ可使BBB的緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的完整性得到損傷[28]。PKCε通過(guò)上調(diào)claudin-5表達(dá)增強(qiáng)BBB的完整性，而PKCδ通過(guò)改變緊密連接蛋白定位來(lái)增加血腦屏障的通透性[29]。PKCα和PKCδ是ERK1/2分裂原激動(dòng)蛋白激酶通路的初始階段，它們可以調(diào)節(jié)MMP-9的激動(dòng)。MMPs過(guò)分的激活和表達(dá)可引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致膠原、黏蛋白和層黏連蛋白基質(zhì)的分裂，最終引起細(xì)胞的遷移和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，大量有毒分子進(jìn)入大腦[30]。苔蘚抑素是一個(gè)PKC調(diào)節(jié)劑，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[31]，老年雌性大鼠在MCAO 2 h給予苔蘚抑素，6 h給予r-tPA可以降低腦水腫，提高存活率。苔蘚抑素可明顯上調(diào)PKCε的活力，降低中風(fēng)后MMP-9的表達(dá)，但不影響MMP-2的表達(dá)，減少BBB緊密連接蛋白的損傷和降低t-PA再灌注損傷后出現(xiàn)出血現(xiàn)象的風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)t-PA治療時(shí)間窗促進(jìn)有效安全溶栓。

西洛他唑是一個(gè)選擇性磷酸二酯酶Ⅲ抑制劑、抗血小板藥物，它通過(guò)增加cAMP和環(huán)鳥(niǎo)苷酸cGMP水平擴(kuò)張血管[32]。cAMP依賴(lài)性誘導(dǎo)claudin-5的表達(dá)以增強(qiáng)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的屏障功能。研究表明[33-34]，西洛他唑具有神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，并且可以對(duì)抗缺血性腦損傷，能夠減輕MCAO再灌注的大鼠的腦梗死面積，可通過(guò)使缺血損傷最小化來(lái)改善急性缺血性中風(fēng)癥狀。西洛他唑不僅具有神經(jīng)保護(hù)功能，它還可以對(duì)抗t-PA治療缺血后再灌注引起的出血轉(zhuǎn)化。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，西洛他唑與t-PA聯(lián)合使用可減輕腦水腫，擴(kuò)大溶栓治療時(shí)間窗，通過(guò)降低MMP-9的活力來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，通過(guò)抑制claudin-5表達(dá)的降低抑制BBB的開(kāi)放，這些改變明顯降低了再灌注小鼠18 h和7 d后的發(fā)病率和死亡率。另有文獻(xiàn)報(bào)道[35]，西洛他唑與其他抗血小板藥物相比能夠減弱出血副作用并不增加出血時(shí)間，對(duì)所有類(lèi)型中風(fēng)患者二次保護(hù)的療效優(yōu)于阿司匹林，保護(hù)患者不受二次出血性中風(fēng)。由此可以推測(cè)磷酸二酯酶抑制劑Ⅲ可能是潛在的治療t-PA引起出血并發(fā)癥的藥物。

?；撬嶙钤鐝呐｜S中分離出來(lái)，據(jù)研究報(bào)道[36-37]，其可通過(guò)多種機(jī)制在急性缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。例如，?；撬峥赏ㄟ^(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)來(lái)下調(diào)缺血/缺氧和谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[38]。?；撬徇€可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路減少細(xì)胞因子和中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生從而抑制腦缺血炎性反應(yīng)[39]。CD147是一種基質(zhì)金屬蛋白酶的誘導(dǎo)劑，研究表明[40]，?；撬峥赏ㄟ^(guò)抑制CD147依賴(lài)性MMP-9信號(hào)通路降低缺血性腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的出血性轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)，在大鼠卒中后4 h使用?；撬岷? h后與t-PA聯(lián)用，可以擴(kuò)大t-PA的治療時(shí)間窗至6 h，改善大鼠長(zhǎng)期功能缺損。因此?；撬崤ct-PA聯(lián)用可能成為治療腦卒中的新型療法。

3 結(jié)語(yǔ)

t-PA是目前治療IS的一線(xiàn)藥物，但其狹窄的時(shí)間窗和復(fù)雜的并發(fā)癥限制了患者的臨床獲益。優(yōu)化t-PA溶栓療法有助于減少溶栓后的不良并發(fā)癥，改善患者愈后癥狀等。其中中藥治療腦卒中具有多靶點(diǎn)、多途徑、不良并發(fā)癥少的特點(diǎn)，因此中藥治療腦卒中也成為了近些年的研究熱點(diǎn)[41-42]，但是中藥治療腦卒中的機(jī)制靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。