方 正 ， 肖雅琴 ， 陳秋銘 ， 張 濤 ， 江 波 ， 沐萬(wàn)孟 *

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 食品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

糖類廣泛存在于自然界中，具有廣譜化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物功能。它不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且某些還具有特殊的生理活性。它們之間可以通過(guò)各種類型的酶促反應(yīng)相互轉(zhuǎn)化或合成，如氧化、還原、乙?；悩?gòu)化和差向異構(gòu)化等反應(yīng)。異構(gòu)化反應(yīng)是指在相對(duì)分子質(zhì)量不變的情況下改變化合物的結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，差向異構(gòu)化則要求化合物含有兩個(gè)或兩個(gè)以上手性中心，差向異構(gòu)酶可以將某手性中心的構(gòu)型轉(zhuǎn)換成其相反構(gòu)型，形成的兩種非對(duì)映異構(gòu)體，稱為差向異構(gòu)體。

隨著生活水平的提高，全球肥胖人口在過(guò)去40年中急速增長(zhǎng)。主要原因之一就是飲食中高攝入量的蔗糖和果糖等高熱量的糖類。在這種社會(huì)條件下，不可消化的糖類則具有特別顯著的優(yōu)勢(shì)。在食品工業(yè)中，它們可以作為甜味劑，在滿足人們對(duì)甜味需求的同時(shí)，降低熱量的攝入以及減少齲齒的發(fā)生。有的還表現(xiàn)出對(duì)人體有益的生物活性，如具有益生元、抗腫瘤以及免疫抑制劑的效果[1]。還有一類甜味劑如阿斯巴甜、安賽蜜等，雖然熱量低，甜味強(qiáng)烈，但是對(duì)人體無(wú)益，甚至有害人體健康。而大多數(shù)這類非營(yíng)養(yǎng)型的甜味劑只能通過(guò)化學(xué)合成得到，而化學(xué)合成過(guò)程還可能因?yàn)榛瘜W(xué)試劑引發(fā)重大安全問(wèn)題。有營(yíng)養(yǎng)的功能性糖則可以通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化得到，更安全、方便、節(jié)約能源且對(duì)環(huán)境的污染更小。在這一過(guò)程中，差向異構(gòu)酶則發(fā)揮著非常重要的作用，參與著糖類的代謝和轉(zhuǎn)化。

日本香川大學(xué)教授Izumori[2]提出了一種名為“Izumoring”系統(tǒng)的生物制備策略，認(rèn)為理論上所有單糖或糖醇都可以從某種單糖通過(guò)生物合成或轉(zhuǎn)化得到。通過(guò)這種策略，可以將豐富廉價(jià)的自然資源合成罕見(jiàn)且昂貴的稀有糖。與單糖相比，天然存在的來(lái)源豐富的二糖也可以發(fā)生類似的酶促反應(yīng)而得到具有特殊功能的稀有二糖。由于一些具有生物活性的二糖在食品工業(yè)中作為功能性甜味劑有著廣闊的應(yīng)用前景，一種被稱為纖維二糖2-差向異構(gòu)酶（CE，EC 5.1.3.11）的二糖差向異構(gòu)酶引起科研工作者們的關(guān)注[3]。大量的研究表明纖維二糖2-差向異構(gòu)酶可以將某些由β-1，4糖苷鍵的寡糖經(jīng)差向異構(gòu)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為依匹乳糖，部分則可催化異構(gòu)化反應(yīng)生成乳果糖，而這兩種乳糖衍生物都是符合當(dāng)今時(shí)代的健康飲食觀念，具有很大的市場(chǎng)發(fā)展前景的功能性稀有糖。本文著重從工業(yè)應(yīng)用角度總結(jié)纖維二糖2-差向異構(gòu)酶酶促反應(yīng)的最新進(jìn)展。

1 纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)

1.1 纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的生物分布及特性

1967年，Tyler和Leatherwood[4]在一種厭氧瘤胃細(xì)菌白色瘤胃球菌中發(fā)現(xiàn)纖維二糖2-差向異構(gòu)酶，因其能催化纖維二糖生成 4-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-甘露糖而得名。但是其真正進(jìn)入人們的視野，開(kāi)始對(duì)纖維二糖2-差向異構(gòu)酶進(jìn)行深入的研究是在40年后，Ito等測(cè)得來(lái)源于R.albus NE1的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶基因序列[5]，并首次發(fā)現(xiàn)該酶能夠催化乳糖生成依匹乳糖[6]。此后大量不同微生物來(lái)源的被證明具有纖維二糖2-差向異構(gòu)酶活性的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶相繼被克隆表達(dá)。2012年，Kim等發(fā)現(xiàn)來(lái)自Dictyoglomus turgidum的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶還可以將乳糖轉(zhuǎn)化為乳果糖[7]。

纖維二糖2-差向異構(gòu)酶屬于N-乙酰-D-葡糖胺-2-差向異構(gòu)酶（EC 5.1.3.8，AGEs）超家族，大多數(shù)纖維二糖2-差向異構(gòu)酶與N-乙酰-D-葡糖胺2-差向異構(gòu)酶氨基酸序列的同源性很低，且在已報(bào)道的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶中沒(méi)有一個(gè)顯示出有N-乙酰-D-葡糖胺-2-差向異構(gòu)酶的活性。迄今為止，來(lái)自厚壁菌、網(wǎng)團(tuán)菌、螺旋體、綠彎菌、變形菌和硬壁菌門，6個(gè)門的19個(gè)細(xì)菌的CE已經(jīng)被異源表達(dá)和表征。為了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需求，研究每個(gè)酶的酶學(xué)性質(zhì)，以面對(duì)不同底物，不同生產(chǎn)環(huán)境來(lái)選擇最合適的酶是具有重要意義的，除了對(duì)基本的最適pH值、溫度等的探究，纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)也是依匹乳糖轉(zhuǎn)化的重要參數(shù)。現(xiàn)將已報(bào)道的19種纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的研究結(jié)果整理如表1所示。其中只有來(lái)源于R.marinus和P.heparinus的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的最適pH為弱酸性6.3。在食品工業(yè)中，弱酸性的條件更適用于工業(yè)生產(chǎn)。而不同纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的最適溫度范圍（35～80℃）則較廣。

表1 已報(bào)道的纖維二糖差向異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)比較Table 1 Comparison of enzyme properties of various Cellobiose 2-epimerase

1.2 纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)-催化活性關(guān)系

解析晶體結(jié)構(gòu)對(duì)于預(yù)測(cè)催化機(jī)理是必需的，Rual-CE，Rhma-CE和Casa-CE的晶體結(jié)構(gòu)已被解開(kāi)，其基本支架是呈（α/α）6的桶狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)內(nèi)外側(cè)均為6個(gè)α螺旋組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的結(jié)合口袋也位于這6個(gè)內(nèi)部螺旋。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫(kù)（SCOP）中，這是六發(fā)夾酶超家族和N-乙酰-D-葡糖胺-2-差向異構(gòu)酶的特征，猜測(cè)該結(jié)構(gòu)適用于催化含甘露糖殘基的碳水化合物的差向異構(gòu)化或異構(gòu)化反應(yīng)。

2013年，F(xiàn)ujiwara等[17]基于Rual-CE晶體結(jié)構(gòu)，針對(duì)纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的差向異構(gòu)化機(jī)制提出了涉及廣義酸/堿催化劑和烯醇化中間產(chǎn)物的理論。一年后，該科研團(tuán)隊(duì)對(duì)Rhma-CE及其反應(yīng)產(chǎn)物 4-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-甘露糖、依匹乳糖結(jié)合態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析[18]，并對(duì)催化機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步分析，如圖2所示。被廣泛接受的是，催化反應(yīng)可以被總結(jié)為以下3步：開(kāi)環(huán)、差向異構(gòu)化、閉環(huán)。在開(kāi)環(huán)中，廣義酸性催化劑向質(zhì)子內(nèi)環(huán)氧原子提供質(zhì)子，而廣義堿性催化劑從氧原子上奪取質(zhì)子。在差向異構(gòu)化過(guò)程中產(chǎn)生順式烯二醇中間體，閉環(huán)過(guò)程可認(rèn)為是開(kāi)環(huán)的逆反應(yīng)。

1.3 纖維二糖2-差向異構(gòu)酶產(chǎn)物的測(cè)定

由于乳果糖和依匹乳糖難以分離。因此產(chǎn)物測(cè)定方法的提升對(duì)研究纖維二糖2-差向異構(gòu)酶工作有重要意義。以前，科研工作者們主要通過(guò)離子交換色譜方法來(lái)完全分離和定量乳糖衍生物，通過(guò)改變洗脫液來(lái)改善分離效率，提高靈敏度。但依舊操作復(fù)雜，耗時(shí)久。近年來(lái)，對(duì)纖維二糖2-差向異構(gòu)酶產(chǎn)物的定量測(cè)定主要由裝備有折射率（RI）或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的高效液相色譜法來(lái)檢測(cè)，其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)速度快且靈敏度高，并且可用于分析復(fù)雜食品系統(tǒng)[19]及其酶促反應(yīng)產(chǎn)物[10，20-21]。 2016年，Rentschler等[22]采用雙重高效液相色譜法分析，使用兩種色譜分離技術(shù)的組合，配置在兩個(gè)并行系統(tǒng)中。柱前衍生后，可以在復(fù)雜的食物基質(zhì)如牛奶中準(zhǔn)確地分離乳糖，乳果糖和依匹乳糖。乳樣中檢測(cè)限依匹乳糖為3.3 mg/L，乳糖為4.7 mg/L，乳果糖為1.3 mg/L。此外，薄層色譜法也被廣泛用作粗略的定性方法，以快速確定是否通過(guò)酶促或微生物反應(yīng)產(chǎn)生了依匹乳糖。

2 纖維二糖2-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)功能性寡糖的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，酶在食品和制藥工業(yè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。目的性的酶促反應(yīng)不僅可以增加食品的附加營(yíng)養(yǎng)值，還可以減少資源浪費(fèi)。乳糖的生物轉(zhuǎn)化則是一個(gè)非常成功的案例。在乳制品工業(yè)中，全世界每年會(huì)產(chǎn)生上百萬(wàn)噸的乳糖無(wú)法利用。若不經(jīng)處理就丟棄，不僅伴隨著資源的浪費(fèi)還會(huì)造成大量的環(huán)境問(wèn)題。但是以乳糖為原料可以生產(chǎn)多種衍生物，用纖維二糖2-差向異構(gòu)酶便可將乳糖經(jīng)差向異構(gòu)化或異構(gòu)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為非常有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的依匹乳糖和乳果糖，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。最初人們?cè)诩訜岬呐Ｄ毯徒?jīng)堿性處理的乳糖溶液中發(fā)現(xiàn)了微量的依匹乳糖，由于難以制備，其生理功能一直不清楚。直到2004年，Miyasato等[23]報(bào)道了由β-半乳糖苷酶催化轉(zhuǎn)糖基作用生產(chǎn)小于10 g規(guī)模的依匹乳糖。乳果糖最初也是在加熱后的牛奶中找到的，不同的是，乳果糖在20世紀(jì)60年代，就已經(jīng)大規(guī)模生產(chǎn)并且應(yīng)用于制藥行業(yè)。下文將對(duì)CE的這兩種主要產(chǎn)物，以及CE在乳產(chǎn)品中的應(yīng)用分別進(jìn)行論述。

圖1 乳糖、依匹乳糖、乳果糖結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of lactose,lactose and lactulose

圖2 Rhma-CE的蛋白分子結(jié)構(gòu)和其與底物（依匹乳糖）結(jié)合情況示意圖Fig.2 Molecular structure of protein Rhma-CE and its interaction with substrate(galactose)

2.1 依匹乳糖

2.1.1 依匹乳糖的生理功能 依匹乳糖（Epilactose：C12H22O11；4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-甘露糖）是乳糖的C2位的差向異構(gòu)體，具有還原性。依匹乳糖不易被人體消化吸收[24]，它在腸道消化酶中非常穩(wěn)定，可以到達(dá)宿主的下胃腸道刺激雙歧桿菌的生長(zhǎng)[25]，所以服用依匹乳糖后血漿內(nèi)的血糖濃度不會(huì)升高。由于攝入依匹乳糖后礦物質(zhì)吸收增強(qiáng)，可能是通過(guò)增殖的腸道細(xì)菌產(chǎn)生短鏈脂肪酸降低pH值而引起。Suzuki等[26]研究發(fā)現(xiàn)依匹乳糖通過(guò)誘導(dǎo)肌球蛋白輕鏈的磷酸化反應(yīng)促進(jìn)鈣運(yùn)輸?shù)募?xì)胞途徑來(lái)增強(qiáng)鈣吸收。使大鼠實(shí)驗(yàn)中胃切除術(shù)后骨量流失的癥狀以及貧血癥得到改善[27]，這表明依匹乳糖可能成為預(yù)防骨質(zhì)疏松和貧血的優(yōu)質(zhì)功能食品。小鼠口服還能夠抑制初級(jí)膽汁酸向次級(jí)膽汁酸的轉(zhuǎn)化，降低患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。依匹乳糖的攝入還能增加盲腸壁的重量，提升短鏈脂肪酸和其他有機(jī)酸的含量，降低血漿中總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量，從而降低動(dòng)脈硬化的發(fā)病率[28]。依匹乳糖還可以有效地預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖[29]，口服依匹乳糖可以增加解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)，解偶聯(lián)蛋白1在骨骼肌和棕色脂肪組織中參與能量耗散的表達(dá)，從而導(dǎo)致全身能量消耗增加，減少小鼠肥胖及代謝障礙的危險(xiǎn)。綜上，依匹乳糖具有預(yù)防結(jié)腸癌、動(dòng)脈硬化、肥胖及其相關(guān)疾病的潛力，而這些慢性病被認(rèn)為是中發(fā)達(dá)國(guó)家的主要健康問(wèn)題。

2.1.2 依匹乳糖的合成 有報(bào)道采用化學(xué)方法通過(guò)乳糖差向異構(gòu)化產(chǎn)生依匹乳糖，或者經(jīng)D-甘露糖和D-半乳糖合成依匹乳糖[30]。但這些化學(xué)方法步驟繁多且復(fù)雜，反應(yīng)涉及的有機(jī)試劑還可能會(huì)引發(fā)重大人身及食品安全問(wèn)題。有機(jī)化學(xué)反應(yīng)副產(chǎn)物較多，純化較困難、工作量大。而酶法催化生成依匹乳糖，因其操作簡(jiǎn)單、安全高效、方便環(huán)保受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

使用單一催化劑纖維二糖2-差向異構(gòu)酶，不需要其他底物就可從乳糖一步轉(zhuǎn)化為依匹乳糖。當(dāng)反應(yīng)中酶濃度較低，反應(yīng)時(shí)間較短時(shí)，反應(yīng)體系中基本檢測(cè)不到副產(chǎn)物[16]。Saburi等使用固定在陰離子交換樹(shù)脂上的Rhma-CE連續(xù)反應(yīng)[31]，有效地減少了反應(yīng)所需酶量。在該反應(yīng)中，大約30%的乳糖被轉(zhuǎn)化為依匹乳糖，通過(guò)乳糖結(jié)晶，水解剩余乳糖，消化單糖以及陽(yáng)離子交換層析純化依匹乳糖至純度為91.1%，回收率為42.5%。2016年，Kuschel團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種半制備型高效液相色譜方法[32]，由fljo-CE催化乳糖大量生產(chǎn)依匹乳糖，經(jīng)結(jié)晶和色析法分離后，獲得高純度（99%）產(chǎn)品，總產(chǎn)量為51%。2018年，Chen等[33]報(bào)道了一條食品級(jí)的從乳糖酶法生產(chǎn)并純化依匹乳糖的路線。利用不使用抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選的枯草芽孢桿菌表達(dá)CE，排除了抗生素基因的不安全因素的情況下生產(chǎn)依匹乳糖，并分3步將產(chǎn)物純化至純度大于98%。

2.2 乳果糖

2.2.1 乳果糖的生理功能 乳果糖（lactulose：C12H22O11；4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖）是半乳糖和果糖通過(guò)β-1，4糖苷鍵結(jié)合得到具有還原性的雙糖，也是乳糖的酮糖異構(gòu)體。乳果糖穩(wěn)定性好、熱值低，為6.28 kJ/g。

與依匹乳糖相類似，乳果糖不會(huì)被人體的腸道消化，留存在腸道中的乳果糖能刺激腸道的蠕動(dòng)，并為腸道中的乳桿菌和雙歧桿菌提供能量[34-35]，有助于維持或恢復(fù)人體小腸中菌群的自然平衡[36]?？诜楣沁€可以刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)分泌免疫球蛋白A[37]，增加腸道局部免疫力，同時(shí)乳果糖被發(fā)酵分解為乳酸、甲酸等小分子有機(jī)酸，使腸道的pH降低，抑制有害菌的生長(zhǎng)代謝，保持水分，有防止便秘的功能。相對(duì)于其他功能性低聚糖主要應(yīng)用于保健食品，乳果糖被大量應(yīng)用于醫(yī)藥方面的研究。肝性腦病是與嚴(yán)重發(fā)病率和死亡率相關(guān)的急性和慢性肝病的嚴(yán)重并發(fā)癥，國(guó)內(nèi)外許多科研工作者通過(guò)隨機(jī)試驗(yàn)分析表明乳果糖對(duì)肝性腦病表現(xiàn)和預(yù)防肝性腦病發(fā)作具有有益作用[38-39]。

2.2.2 乳果糖的合成 目前，用于商業(yè)利用的乳果糖主要通過(guò)化學(xué)方法生產(chǎn)[40]。由于化學(xué)方法生產(chǎn)過(guò)程包括復(fù)雜的純化和脫鹽步驟，而使用生物催化劑的環(huán)境友好型合成方法優(yōu)于常規(guī)的化學(xué)反應(yīng)。所以科研工作者們一直在積極探索，想要通過(guò)酶促生物轉(zhuǎn)化的方式大量生產(chǎn)乳果糖，同時(shí)降低生產(chǎn)成本。

據(jù)報(bào)道，糖基水解酶和纖維二糖2-差向異構(gòu)酶是目前所知能夠催化合成乳果糖的兩類酶。纖維二糖2-差向異構(gòu)酶可直接將乳糖還原性末端的葡萄糖基異構(gòu)化為果糖基，實(shí)現(xiàn)乳糖向乳果糖的直接轉(zhuǎn)化。2012年，Kim等將來(lái)自嗜糖假單胞菌的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的異構(gòu)化活性用于高效酶促生產(chǎn)乳果糖[41]。一年后，該團(tuán)隊(duì)在硼酸鹽存在下的乳糖溶液中使用Casa-CE產(chǎn)生乳果糖[42]，轉(zhuǎn)化率提升至88%，是通過(guò)化學(xué)或生物合成所實(shí)現(xiàn)的最高水平。然而，從反應(yīng)產(chǎn)物中除去硼酸鹽是困難且昂貴的。加入硼酸鹽還會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染和安全問(wèn)題，這就失去了生物法的優(yōu)點(diǎn)。而在沒(méi)有硼酸的條件下，2016年，Shen等經(jīng)過(guò)四輪隨機(jī)誘變和篩選[43]，獲得最佳突變體G4-C5，乳果糖產(chǎn)量增加至約76%。由于生產(chǎn)乳果糖溫度較高，以前認(rèn)為來(lái)自于嗜熱微生物的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶才能應(yīng)用于乳果糖的生產(chǎn)，2017年，Kuschel等發(fā)現(xiàn)來(lái)自于嗜溫微生物的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶也可以發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)生成乳果糖[44]，這可能意味著所有的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶都有異構(gòu)化活性，只是活力的高低有區(qū)別而已。

2.3 纖維二糖2-差向異構(gòu)酶在乳制品中的應(yīng)用

隨著對(duì)乳糖衍生物中功能性稀有糖的研究與開(kāi)發(fā)，近年來(lái)，研究工作集中于在工業(yè)相關(guān)溫度下直接在原料乳中生產(chǎn)所需要的乳糖衍生物，為特定的乳制品引入附加價(jià)值。與乳糖相比，其功能性衍生物具有更高的價(jià)值，不僅可以避免部分人群對(duì)乳糖的不耐受，還可以在食用乳制品的同時(shí)攝取到具有功能性的乳糖衍生物，同時(shí)也減少了從原乳中提取乳糖的步驟。此舉不僅可以產(chǎn)生具有益生元特性的富含功能性乳糖衍生物的乳制品或益生元產(chǎn)品制劑，還可以擴(kuò)大功能性食品范圍，提供了將乳清或乳清滲透物等副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的益生元產(chǎn)品的機(jī)會(huì)，提高副產(chǎn)品乳清的價(jià)值。根據(jù)制作工藝的不同，獲得含有不同乳糖衍生物的乳制品，從而讓有不同需求的人們有選擇性地購(gòu)買。

將纖維二糖2-差向異構(gòu)酶運(yùn)用到乳制品的生產(chǎn)工業(yè)中有兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題需要解決，首先是安全問(wèn)題，使用食品級(jí)菌生產(chǎn)的CE能消除致病菌所產(chǎn)生的安全隱患，且使用過(guò)程中不需要添加抗生素，能避免抗生素的濫用，作者利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型枯草芽孢桿菌宿主構(gòu)建了生產(chǎn)CE的食品級(jí)工程菌，能夠安全進(jìn)行CE的生產(chǎn)，使其能夠直接應(yīng)用于乳制品的乳糖轉(zhuǎn)化[33，45]。

第二個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題在于乳品的保質(zhì)期較短，并且成分復(fù)雜，想要快速，便捷，減少副產(chǎn)物的生成來(lái)獲得目的乳糖衍生物，就需要尋找在低溫下有高效酶活的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶。乳制品的工業(yè)生產(chǎn)一般在8℃低溫下進(jìn)行以避免其他微生物污染或化學(xué)副反應(yīng)的發(fā)生。而在此低溫下大多數(shù)酶的活性一般較低，直接導(dǎo)致生產(chǎn)效率低下。2014年，Krewinkel等[46]發(fā)現(xiàn)來(lái)自2種嗜溫微生物，約氏黃桿菌和肝素桿菌的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶，這兩種酶在低溫下都具有相當(dāng)?shù)幕钚?，能夠在?fù)雜的牛奶系統(tǒng)中將乳糖轉(zhuǎn)化成依匹乳糖，且沒(méi)有檢測(cè)到其他副產(chǎn)物的生成。該團(tuán)隊(duì)在2015年[47]將來(lái)自無(wú)色單胞菌的CE在12 L的攪拌罐反應(yīng)器中生產(chǎn)并使用自動(dòng)系統(tǒng)對(duì)酶進(jìn)行純化。以此規(guī)模的酶的生產(chǎn)和純化來(lái)表明，纖維二糖2-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)的升級(jí)，及其在食品工業(yè)中應(yīng)用的可能性。酶促反應(yīng)在原料乳中的應(yīng)用可能導(dǎo)致其被整合到乳制品的加工中，而在該過(guò)程結(jié)束后，通過(guò)超高溫短時(shí)滅菌的處理使纖維二糖2-差向異構(gòu)酶失活，同時(shí)這也是工業(yè)上乳制品滅菌必須要經(jīng)過(guò)的步驟。同樣在2015年，Rentschler等人[15]從一種嗜熱纖維素分解菌中分離得到的纖維二糖2-差向異構(gòu)酶首次在工業(yè)相關(guān)溫度下直接在牛奶中產(chǎn)生乳果糖。每升牛奶中最多可產(chǎn)生28.0 g的乳果糖。通常酶的穩(wěn)定性與其在低溫下的酶活成反相關(guān)，酶的穩(wěn)定性越好，柔韌性就更弱，在低溫下與底物結(jié)合能力也越弱。因此為了提升纖維二糖2-差向異構(gòu)酶在低溫下的酶活，就應(yīng)當(dāng)結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的信息，對(duì)酶的某些氨基酸殘基進(jìn)行分子改造，以提升蛋白質(zhì)的柔韌性。這種分子改造策略與尋找耐高溫酶的策略相反，目前還沒(méi)有人進(jìn)行此類的報(bào)道，需要未來(lái)進(jìn)行更多的嘗試。

3 展望

功能性糖的興起將減少高熱值的甜味化合物如蔗糖的使用，減少了患糖尿病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。也符合現(xiàn)在低卡路里和低糖的生活觀念。對(duì)纖維二糖2-差向異構(gòu)酶催化反應(yīng)的研究為合成乳糖衍生物提供了新的方向。酶促反應(yīng)沒(méi)有額外的底物，也沒(méi)有冗長(zhǎng)的步驟，純化簡(jiǎn)單，高效環(huán)保。酶促反應(yīng)生產(chǎn)將成為未來(lái)功能性食品原料生產(chǎn)的主要趨勢(shì)。酶工程技術(shù)是發(fā)現(xiàn)新酶及提高酶學(xué)性質(zhì)最有力的工具。當(dāng)前纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)和突變實(shí)驗(yàn)還比較少，隨著未來(lái)通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，全面了解纖維二糖2-差向異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系和酶促催化機(jī)理，相信乳糖衍生物行業(yè)面貌將煥然一新。