孫海龍， 李佳益， 張 敏， 曾傲瓊， 倪永清*

（1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

長期研究發(fā)現(xiàn)，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少，且在人體中具有重要生理功能的有益菌，它們在人類腸道中起著很大生理作用。這些有益菌擁有抗酸和膽汁、粘附人類上皮細(xì)胞、在人類腸道中繁殖、產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)的特性。

以乳酸菌為生物保鮮劑用于果蔬和肉制品的保鮮已有不少報(bào)道[1-2]。Martinez等[3]將Lactobacillus plantarum菌液噴涂于荔枝、紅毛丹果實(shí)表皮，發(fā)現(xiàn)能夠降低致病菌的數(shù)量，同時(shí)還能抑制其褐變保持果皮的色澤、降低水分損失，延長果實(shí)貨架期。果蔬富含礦物質(zhì)、維生素、膳食纖維和抗氧化劑等有益的營養(yǎng)物質(zhì)，且沒有限制少數(shù)特定群體消費(fèi)的乳品過敏原，因此使得果蔬成為傳遞益生菌的理想載體[4]。Raffaello等以卷心菜為原料[5]，將 Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、Lactobacillus delbrueckii加入滅菌的未添加其他營養(yǎng)物質(zhì)的卷心菜汁里，乳酸菌能快速繁殖，30℃發(fā)酵48 h后，細(xì)胞數(shù)量高達(dá)108cfu/mL，且Lactobacillus.plantarum、Lactobacillus.delbrueckii比Lactobacillus.casei能產(chǎn)生更多的可滴定酸。

由于易受到快速腐敗微生物及一些病原體污染，新鮮的水果和蔬菜保質(zhì)期較短，很容易腐爛變質(zhì)。巴氏滅菌以及添加化學(xué)防腐劑是保證果蔬安全的主要技術(shù)操作，但同時(shí)也會(huì)帶來如物理特性、化學(xué)成分變化等不理想的改變[6]。為避免這些缺陷，利用產(chǎn)細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)的乳酸菌，開發(fā)果蔬汁益生菌功能飲料以及作為天然抗菌防腐劑應(yīng)用于果蔬貯藏保鮮等新技術(shù)備受關(guān)注[5，7-9]。具有產(chǎn)細(xì)菌素能力的乳酸菌對(duì)不同食物腐敗或病原菌都表現(xiàn)出一定的抑制能力，且具有安全、無殘留、抗菌譜廣等優(yōu)勢，這類產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌在乳品加工、果蔬加工、水產(chǎn)品、肉制品等領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)取得顯著成果[10-12]。許多研究已經(jīng)證明[3，5-6，13-14]，添加產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌到食品中比直接添加細(xì)菌素更可取。作為一類天然的、安全的食品抗菌防腐劑，乳酸菌可以較好地抑制致病菌及腐敗菌的生長，從而保證食品的質(zhì)量，提高食品的安全性；這使得乳酸菌作為抗菌防腐劑在食品保鮮技術(shù)中的優(yōu)勢日漸凸顯，在未來天然食品生物防腐劑研究與開發(fā)中有極大的應(yīng)用潛力。

新疆盛產(chǎn)瓜果、蔬菜，且營養(yǎng)高、口感好。由于新疆特殊的地理環(huán)境及氣候多變性，較好地保存了當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境中的有益微生物，是乳酸菌的天然儲(chǔ)存庫。對(duì)新疆不同地區(qū)水果中乳酸菌進(jìn)行分離、鑒定及生物學(xué)特性研究，篩選出具有抑菌活性的乳酸菌，為進(jìn)一步開發(fā)果蔬汁益生菌功能飲料及加速天然食品防腐劑在食品保鮮中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從新疆不同地區(qū)（伊犁、塔城、喀什、石河子等地）用提前滅菌的工具采集野生沙棘、沙棗、蘋果、海棠果、山楂、石榴、葡萄、庫爾勒香梨等樣品（每種取樣2～3份），裝入提前滅菌的保鮮盒內(nèi)，貼上標(biāo)簽后放置于車載冰箱-4℃冷藏，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。樣品立即在無菌條件下處理，將其表皮用滅菌刀具削下放入裝有30 mL MRS液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h，4℃保藏備用。

1.2 主要試劑和儀器

用于PCR擴(kuò)增的全套試劑均購自TaKaRa公司。所用培養(yǎng)基及相關(guān)藥品均購自海博生物技術(shù)有限公司。生理生化試驗(yàn)所用試劑購自天津市巴斯夫化學(xué)試劑廠。PCR儀為德國Biometra公司的Tprofessional；凝膠成像儀為美國BioRad公司Gel DOC XR；水平電泳儀為美國BioRad公司的PowerPac Universal。

1.3 菌株分離純化

采用梯度稀釋平板涂布法分離樣品中的乳酸菌。取 10-2、10-3、10-43 個(gè)梯度稀釋樣品 150 μL 分別涂布于MRS、Elliker、M17、乳酸桿菌選擇性瓊脂4種固體培養(yǎng)基上，一式兩份，37℃厭氧培養(yǎng)2 d。待菌落長出后挑取單菌落，劃線培養(yǎng)3次后，將所得純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基[15]。菌株的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)進(jìn)行[16]，通過革蘭氏染色和接觸酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初篩，初步確定疑似乳酸菌。

1.4 菌株rep-PCR指紋圖譜分析

采用CTAB法提取菌株單菌落DNA。用引物GTG5 （5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′） 對(duì)分離菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17-18]。反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行， 包括 2×PCR Master Mix 12.5 μL，0.5 μmol/L MgCl22.0 μL， 引物 1 μL，2 μL 的模板以及 7.5 μL的ddH2O。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；40℃退火 30 s；65 ℃延伸 8 min；32 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸16 min。PCR結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為14 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測2 h。在紫外凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果，DNA帶型完全一致的菌株被認(rèn)為屬于同一物種，從中選取表菌株作進(jìn)一步16S rRNA基因測序分析。

1.5 16S rRNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

用引物 27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)菌株進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增[17，19]。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 4 min，94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序，將所得序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，利用BLAST進(jìn)行序列同源性分析，比較供試菌株與已知乳酸菌相應(yīng)序列的相似性。在MEGA 6.0軟件中用p-distances和Kimura-2parameter雙參數(shù)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)[20]。

1.6 牛津杯法篩選具有抑菌活性的乳酸菌

分別吸取100 μL指示菌 （金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、單增李斯特菌 Listeria monocytogenes）稀釋液（活菌數(shù)達(dá)到2.0×108cfu/mL）涂布于已凝固的LB固體培養(yǎng)基，用滅菌棉簽均勻涂抹，在每個(gè)平板中等距放置4個(gè)牛津杯，再分別加入200 μL的乳酸菌上清液，用未加菌液的培養(yǎng)基為空白對(duì)照[21]。放置于4℃冰箱中擴(kuò)散5 h后，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。若在牛津杯周圍出現(xiàn)抑菌圈，則表示該菌株可以產(chǎn)細(xì)菌素，具有抑菌活性；用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，每株菌做3個(gè)平行，求平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌生理生化鑒定

從沙棘、沙棗、蘋果、海棠果、山楂、葡萄、紅棗等樣品中共分離得到純培養(yǎng)物137株。通過革蘭氏、接觸酶實(shí)驗(yàn)初步確定疑似乳酸菌共90株。如圖1所示，菌株菌落形態(tài)大多為白色或乳白色，邊緣整齊，直徑在0.5～2 mm之間，表面較濕潤，易于挑起。90株植物菌株中有32株菌落顏色呈白色，36株菌落顏色呈乳白色，17株菌落顏色呈淡黃色；透明或半透明狀4株，淡灰色1株。鏡檢發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)分離菌株細(xì)胞形態(tài)呈桿狀或球狀。

圖1 乳酸菌菌落形態(tài)及其細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colonies and cell morphology of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌16S rRNA基因序列鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育

DNA帶型完全一致的菌株通常被認(rèn)為屬于同一物種。對(duì)90株疑似乳酸菌通過rep-PCR指紋圖譜表征分析，顯示出15種不同的DNA帶型。結(jié)合表性特征及指紋圖譜結(jié)果，選取15株代表菌株進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增及測序分析。

將測序得到的序列提交到NCBI，在GenBank數(shù)據(jù)庫中利用BLAST在線工具與已知的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選取相似度最高的序列，分析其親緣關(guān)系并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如表1所示，16S rRNA鑒定結(jié)果表明分離菌株主要隸屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬 Leuconostoc）和乳球菌屬（Lactococcus）3個(gè)屬。其中Lactobacillus 6株， 包括 Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillusplantarum 5 個(gè) 種 ；Leuconostoc 8株，包括Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc pseudomesenteroides、Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicum 3個(gè)種；而Lactococcus只分離到一株B-11-5，屬于Lactococcus lactis。

由系統(tǒng)發(fā)育樹可知（圖2），被測菌株16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性相似性在98%～100%之間。 M-PC-4、M-PC-12、M-PC-15、MPC-17、M-PC-18、M-PC-19 聚為一群，均屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）；其中 M-PC-4 與 Lactobacillus plantarum，M-PC-12 、M-PC-19 與 Lactobacillus alimentarius，M -PC -17 與 Lactobacillus paralimentarius，M-PC-18 與 Lactobacillus kimchii的相似度均達(dá)到了100%；M-PC-15與Lactobacillus paraplantarum的相似度達(dá)到了99%，因此它們均隸屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）。M-5-1、E-5-7、M-6-3、B-5-12、M-11-13、M-11-13 與 Leuconostoc mesenteroides的相似度為99%～100%之間，M-5-6、E-5-8與Leuconostoc pseudomesenteroides的相似度為100%，可以確定屬于明串珠菌屬（Leuconostoc）。 而 B-11-5 與 Lactococcus lactis的相似度為100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成一個(gè)單獨(dú)分支。

表1 乳酸菌鑒定及表型特征Table 1 Identification and phenotypic characteristics of Lactic acid bacteria

2.3 具有抑菌活性乳酸菌的篩選

乳酸菌通常能夠抑制與其種屬相近的菌株，利用15株已鑒定的乳酸菌作為目標(biāo)菌，分別以金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、李斯特氏菌作為指示菌篩選具有抑菌活性的菌株。結(jié)果顯示分別來自Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus.alimentarius、Lactobacillus. paraplantarum、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis 5個(gè)種的乳酸菌具有抑制指示菌生長的能力。不同乳酸菌所產(chǎn)生的抑菌圈直徑在8～20 mm范圍內(nèi) （牛津杯直徑為7 mm）；抑菌效果由表2可知，不同種乳酸菌對(duì)不同指示菌的抑菌程度不同，如圖3所示。

圖2 基于16S rRNA序列的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of the 16S rRNA gene

表2 對(duì)指示菌抑菌活性Table 2 Antibacterial spectrum for indicator bacteria

圖3 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選Fig.3 Screening for bacteriocin-producing strains

3 結(jié)語

本研究利用4種培養(yǎng)基對(duì)8種新疆不同地區(qū)水果表皮可培養(yǎng)乳酸菌分離進(jìn)行了分離純化。16S rDNA序列分析確定15株代表菌株分別隸屬于乳桿菌屬、明串珠菌屬和乳球菌屬3個(gè)屬，共8個(gè)種。抑菌研究結(jié)果表明，Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis 5個(gè)種的8株乳酸菌對(duì)不同指示菌在一定程度上都有抑制作用，不同種乳酸菌對(duì)不同指示菌的抑菌程度不同。

本研究從不同水果中分離所得乳酸菌主要是Leuconostoc和 Lactobacillus， 尤 其 Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus plantarum是水果表皮的優(yōu)勢菌群，并且以其作為生物保鮮劑用于果蔬貯藏保鮮已有不少報(bào)道[1-3，5，7-8，14]。 明串珠菌和乳桿菌屬菌株多數(shù)都能抑制金黃色葡萄球菌和李斯特菌的生長，但對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果并不明顯。目前，Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus delbrueckii、Lactococcus lactis 是 果 蔬乳酸發(fā)酵中最常見的菌種[1，5，22]。 有研究指出[6，22]，乳酸發(fā)酵過程中，當(dāng)果蔬汁作為唯一的發(fā)酵底物時(shí)，由于葡聚糖蔗糖酶的合成，明串珠菌可選擇性地促進(jìn)一些乳桿菌和雙歧桿菌的生長，從而平衡腸道微生物組成。Raffaella等通過 Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei、Lactobacillus delbrueckii等研究了番茄汁是否適合生產(chǎn)益生菌產(chǎn)品，結(jié)果表明，4種乳酸菌都能在沒有調(diào)節(jié)番茄汁PH和補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)的情況下，快速繁殖并產(chǎn)酸。且在4℃冷藏4周后，L.plantarum、L.delbrueckii依然能在低pH、高酸度條件下生存[5-6]。L.plantarum具有較廣的抑菌普，能抑制多種致病菌的生長。Martinez等[3]用L.plantarum菌液噴涂荔枝，并在10℃條件下貯藏，延緩了果皮褐變。李轉(zhuǎn)羽等[6，23]研究發(fā)現(xiàn)，除金黃色葡萄球菌、李斯特菌等革蘭氏陽性菌外，L.plantarum對(duì)沙門氏菌、志賀氏菌、阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性菌也有明顯抑制作用。

本研究前期對(duì)新疆不同地區(qū)水果中的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)具有抑菌活性的乳酸菌進(jìn)行了初步篩選。后續(xù)研究中，會(huì)對(duì)分離菌株的生長特性及抑菌能力進(jìn)行拓展實(shí)驗(yàn)，以期更加準(zhǔn)確地了解其抑菌活性及相關(guān)抑菌物質(zhì)的功能性質(zhì)。為進(jìn)一步開發(fā)果蔬汁益生菌功能飲料及加速天然食品防腐劑在食品保鮮中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。