張雷 邢賽 彭昊*方洪松 黃冠予 梁世博

激素性股骨頭缺血性壞死（steroidinduced avascular necrosis of the femoral head,SANFH）是非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的最常見病因，其主要原因?yàn)殚L(zhǎng)期或短時(shí)間大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，導(dǎo)致股骨頭內(nèi)循環(huán)障礙，引起股骨頭塌陷、髖關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙。國(guó)內(nèi)外對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究，成骨細(xì)胞凋亡機(jī)制逐漸成為研究的熱點(diǎn)。SANFH中的細(xì)胞凋亡通路是一個(gè)多因素、多水平的復(fù)雜的調(diào)控過程，目前國(guó)內(nèi)外的主要研究成果包括：Wnt/-catenin、STAT1-caspase3、Akt/Bad/Bcl-2、RANK/RANKL/OPG和 HIF-1等一些經(jīng)典的凋亡通路[1-5]。本文用地塞米松誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞建立激素性股骨頭壞死的成骨細(xì)胞模型，介紹氧化應(yīng)激介導(dǎo)線粒體凋亡途徑，把ROS與非依賴caspase家族信號(hào)分子凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）相關(guān)聯(lián)，并通過抗氧化劑抑制ROS產(chǎn)生，和鈣蛋白酶抑制劑抑制鈣蛋白酶活性，減少鈣離子內(nèi)流，最終減少AIF的釋放，抑制MC3T3-E1細(xì)胞凋亡，現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系選擇和實(shí)驗(yàn)材料

本文選用小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1），購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司細(xì)胞庫。

地塞米松（D4902-25MG，Sigma，美國(guó)），凋亡誘導(dǎo)因子AIF（D3902 20 L，Rabbit mAb CST，美國(guó)），聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1抗體（SinoBiological，中國(guó)），細(xì)胞色素C抗體（碧云天，中國(guó)），N-乙酰-L-半胱氨酸（規(guī)格1 g，Sigma，美國(guó)），PD151746鈣蛋白酶-1抑制劑（Selleck，美國(guó)）， -Actin Antibody（谷歌，中國(guó)），PVDF膜（0.45 m300mm×4m，EA，德國(guó)），抗兔IgG二抗（CST，美國(guó)）。超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1E，蘇凈，中國(guó)），二氧化碳培養(yǎng)箱（上海智誠(chéng)分析儀器有限公司），電泳儀（北京市六一儀器廠），流式細(xì)胞儀（BD公司）、Odyssey（LI-COR公司，美國(guó)）。

1.1.2 糖皮激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡模型的建立

選擇復(fù)蘇后第2代或第3代的小鼠成骨細(xì)胞系（MC3T3-E1），經(jīng)胰酶消化離心重懸后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)需傳代的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)查閱文獻(xiàn)，需接種的細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，根據(jù)需要加入適量的細(xì)胞原液（本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞原液濃度為1×106個(gè)/L，只需稀釋10倍即可），細(xì)胞過夜等待細(xì)胞貼壁充分（一般需2～4 h），加入地塞米松藥物濃度為1×10-6mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，然后使用流式細(xì)胞儀，與正常組細(xì)胞對(duì)比，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.1.3 細(xì)胞分組

選擇生長(zhǎng)良好的小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系（MC3T3-E1），以1×105個(gè)/mL接種于25 cm培養(yǎng)瓶或六孔板中。48h后貼壁生長(zhǎng)良好，對(duì)細(xì)胞干預(yù)前PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次，然后隨機(jī)將細(xì)胞分為4組：正常組（10%FBS），激素組（地塞米松濃度1×10-6mol/L），NAC組（NAC1mmol/L+地塞米松1×10-6mol/L）和鈣蛋白酶抑制劑 PD151746(PD)組 (PD10 mol/L+地塞米松1×10-6mol/L)，于72h收集細(xì)胞做各種后續(xù)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，設(shè)置未加藥物的含有地塞米松的成骨細(xì)胞組（地塞米松對(duì)照組），未加藥物及地塞米松的細(xì)胞對(duì)照組（細(xì)胞對(duì)照組），以及加入藥物濃度梯度的藥物試驗(yàn)組。地塞米松濃度為1×10-6mol/L，NAC的濃度梯度設(shè)為（0.2、0.5、1、1.5、2 mmol/L），PD151746的濃度梯度設(shè)為（2、5、10、15、20 mol/L），每組重復(fù)3次及以上。將96孔板繼續(xù)放置于溫箱中培養(yǎng)，72h后，待細(xì)胞密度達(dá)到100%時(shí)，用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，在450nm處測(cè)定吸光光度值。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和ROS含量

收集細(xì)胞：細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1500rpm離心5min收集細(xì)胞，棄上清液。PBS洗滌細(xì)胞：加入3 mL 4℃預(yù)冷的PBS完全重懸細(xì)胞，1 500 rpm離心5 min，棄上清液。沉淀震蕩混勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)：移取10 L在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞為1×106～2×108/mL。細(xì)胞標(biāo)記：凋亡使用AnnexinV-FITC和PI溶液，ROS使用DCFH-DA探針。孵育探針：37℃溫箱內(nèi)孵育20 min，3～5 min充分混勻1次，使DCFH-DA和細(xì)胞充分反應(yīng)。然后無FBS潤(rùn)洗細(xì)胞，洗掉殘留細(xì)胞外的探針，以免影響實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。上機(jī)檢測(cè)：流式細(xì)胞儀使用激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)（525±20）nm進(jìn)行檢測(cè)，并分析細(xì)胞凋亡率和ROS含量。

1.2.3 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)ROS含量和鈣離子含量

去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞，ROS加入用無血清培養(yǎng)基稀釋DHE試劑和鈣離子加入Fluo-4/AM熒光探針。37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，無FBS的H-DMEM培養(yǎng)基潤(rùn)洗細(xì)胞，洗掉殘留細(xì)胞外的探針，以免影響實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，放置于暗室等待檢測(cè)。按照掃描的激光共聚焦顯微鏡設(shè)置數(shù)據(jù)為：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515 nm。然后采用Image J軟件得出熒光強(qiáng)度的數(shù)值，其熒光強(qiáng)度即可反映細(xì)胞內(nèi)ROS含量和鈣離子含量。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白的水平

用超純水（去離子水）清洗玻璃板，檢查是否漏水，如漏水則調(diào)整玻璃板至完全密封。根據(jù)目的蛋白的分子量選擇10%分離膠和5%濃縮膠。加入足量的電泳液后，拔出梳子，確定蛋白總量一致，每孔加樣10 L，在樣品兩側(cè)各加marker 3L。將電泳電壓調(diào)整為120 V，時(shí)間90 min，當(dāng)溴酚藍(lán)剛到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。選擇切膠的范圍，220mA恒流轉(zhuǎn)膜90min。封閉后，孵一抗，孵二抗，Odyssey儀器掃膜。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，ROS、Ca2+和蛋白灰度值計(jì)算采用ImageJ軟件，分析和計(jì)算平均熒光密度值，蛋白條帶灰度值。計(jì)量資料采用方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，P＜0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001則認(rèn)為有顯著性意義。作圖工具選用GraphPad Prism 5和 Adobe Photoshop CS 5。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測(cè)成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞增殖

根據(jù)測(cè)得的 CCK-8的OD值，計(jì)算出激素對(duì)照組和正常對(duì)照組的平均OD值，將測(cè)得的加入NAC和PD151746各濃度梯度的OD值代入細(xì)胞存活率公式[6]：細(xì)胞存活率=（藥物試驗(yàn)組OD值－激素對(duì)照組平均OD值）/（正常對(duì)照組平均OD值－激素對(duì)照組平均OD值）。將細(xì)胞存活率值分別輸入 GraphPad Prism 5軟件，得出細(xì)胞存活率線性坐標(biāo)曲線圖（見圖1）和半最大效應(yīng)濃度（EC50）：NAC為1.010mmol/L，PD151746為8.085 mol/L。因此，本研究分別取NAC的實(shí)驗(yàn)濃度為1mmol/L，PD151746的實(shí)驗(yàn)濃度為10 mol/L。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡率

如圖2所示，通過Annexin V-FITC和PI雙染標(biāo)記法進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示，4組凋亡率分別為：正常組（3.24±0.14）%、激素組（11.69±1.42）%、NAC 組（4.52±0.23）%和 PD151746組（4.81±0.11）%，激素組、NAC組和PD組與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.001，0.001和0.000），激素組與NAC組、PD組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.001和0.01）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組成骨細(xì)胞ROS的平均熒光強(qiáng)度

如圖3所示，ROS的熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示4組的熒光強(qiáng)度分別為：正常組（123 547.70±845.92），激素組（161 033.70±1 781.71），NAC 組（131 158.70±1 969.73）和PD組（133 387.70±1 512.25）。激素組、NAC組和PD組與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.001、0.004和0.001），激素組與NAC組、PD組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.002和0.02）。

圖1 NAC和PD151746對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡模型增殖能力的影響

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同藥物處理對(duì)MC3TC-E1成骨細(xì)胞凋亡率的影響

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同藥物處理對(duì) MC3TC-E1成骨細(xì)胞產(chǎn)生ROS含量的影響

2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組Ca2+含量

如圖4所示（彩圖見插頁），采用 Image J圖像處理軟件，計(jì)算每組平均熒光密度值，結(jié)果顯示四組鈣熒光密度值為：正常組（0.0208±0.0003），激素組（0.0334±0.0029），NAC組（0.0249±0.0041）和PD組（0.0258±0.0023）。激素組、NAC組和PD組與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.002、0.026和0.021），激素組與NAC組、PD組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.044和0.001）。

2.5 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組ROS的熒光強(qiáng)度

如圖5所示（彩圖見插頁），采用 Image J圖像處理軟件，計(jì)算每組平均熒光密度值，結(jié)果顯示4組ROS熒光密度值為：正常組（0.0244±0.0012），激素組（0.0322±0.0016），NAC 組（0.0189±0.0012）和 PD 組（0.0278±0.0010）。激素組、NAC組和PD組與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（值分別為0.003、0.005和0.023），激素組與NAC組、PD組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.000和0.017）。

圖5 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)不同藥物處理對(duì)MC3TC-E1成骨細(xì)胞產(chǎn)生ROS熒光強(qiáng)度的影響

2.6 Western blot檢測(cè)各組 MC3T3-E1成骨細(xì)胞表達(dá) AIF、RARP-1和Cyt-c蛋白的水平

如圖6所示，采用ImageJ圖像處理軟件，測(cè)量各蛋白條帶的灰度值與 -actin灰度值的比值。結(jié)果顯示，AIF蛋白：正常組（0.191±0.009），激素組（0.345±0.006），NAC組（0.249±0.006）和 PD 組（0.293±0.007）；PARP-1蛋白：正常組（0.164±0.007），激素組（0.460±0.042），NAC 組（0.342±0.018）和 PD 組（0.380±0.023）；Cyt-c蛋白：正常組（0.247±0.006），激素組（0.430±0.084），NAC 組（0.374±0.013）和 PD 組（0.366±0.011）。其他三組與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；激素組與NAC組、PD組比較，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 Western blot檢測(cè)不同藥物處理對(duì)MC3TC-E1成骨細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

激素性股骨頭缺血性壞死是長(zhǎng)期大量使用糖皮質(zhì)激素類藥物導(dǎo)致的并發(fā)癥之一，好發(fā)于30～50歲的中青年人群，而且致殘率高，往往非手術(shù)治療效果欠佳，全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)成為其最終且可行的唯一治療方法。激素性股骨頭壞死的保髖策略包括非手術(shù)治療：改變生活方式，減輕體重，扶雙拐行走減輕髖部負(fù)重；目前沒有被廣泛認(rèn)可療效客觀的藥物，主要包括一些緩解及減緩病程的藥物，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能（如阿侖膦酸鈉），調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝（如阿托伐他?。┑取Ｊ中g(shù)保髖較為經(jīng)典的手術(shù)且成熟的髓芯減壓術(shù)，以及衍生的髓芯減壓植骨術(shù)，對(duì)早中期激素性股骨頭壞死有較好的療效，能延緩病情進(jìn)展[7,8]，其他還包括坦棒置入術(shù)、帶血管蒂或肌蒂的骨瓣轉(zhuǎn)移術(shù)、骨盆內(nèi)移截骨術(shù)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植等[9-12]，對(duì)早期激素性股骨頭壞死，保髖手術(shù)能一定程度上緩解患者癥狀，延緩病情繼續(xù)惡化，改善髖部功能[13]。

在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨壞死中，氧化損傷出現(xiàn)的時(shí)間要早于骨壞死[14]。童培建等建立大鼠激素性股骨頭壞死模型，并運(yùn)用基因芯片的方法檢測(cè)組織內(nèi)表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)壞死股骨頭組織中表達(dá)較強(qiáng)的氧化應(yīng)激基因，提示 COX6A2、COX412、SOD3和DUSP1基因是氧化應(yīng)激在激素性股骨頭壞死的發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的基因[15,16]。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、依布硒等抗氧化劑能有效阻止激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡，沉默p66shc也能達(dá)到類似效果[17]。3-吲哚甲醇可以通過抑制ROS的過量產(chǎn)生和增強(qiáng)Nrf 2通路的表達(dá)從而達(dá)到抑制糖皮質(zhì)激素性骨細(xì)胞凋亡的效果[18]。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體功能發(fā)生障礙，Bak/Bax介導(dǎo)的孔道呈過表達(dá)狀態(tài)，使Cyt-c從線粒體釋放到胞漿中，從而線粒體呼吸鏈?zhǔn)胶猓娮訌暮粑溨刑右莶⑴cO2作用產(chǎn)生超氧陰離子（O2-），產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

AIF作為第一個(gè)被鑒定出可以不依賴于胱天蛋白酶（caspase）信號(hào)通路而直接介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子，當(dāng)?shù)蛲龀绦蛴|發(fā)是AIF從線粒體釋放易位到核，與染色體DNA結(jié)合，引起細(xì)胞染色體凝聚及DNA大片段碎裂（50 kb）的作用。在細(xì)胞凋亡過程中，AIF被鈣蛋白酶及組織蛋白酶進(jìn)一步水解，最終形成了57 kDa的可溶性且具有凋亡誘導(dǎo)活性的蛋白釋放入細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)揮促凋亡作用[19,20]。有研究報(bào)道，AIF誘導(dǎo)的凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi) Ca2+水平的增加（維持10 min左右）是AIF加工和釋放的先決條件，而瞬時(shí)Ca2+水平的增加是不足以引發(fā)AIF蛋白水解的，Ca2+一方面刺激線粒體分泌ROS，另一方面激活鈣蛋白酶，依次切割膜結(jié)合的AIF，并通過 Bax/Bak介導(dǎo)的孔道或 Ca2+依賴性線粒體通透性轉(zhuǎn)換，從線粒體釋放可溶性片段[21]。

然而激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，本實(shí)驗(yàn)著手目前的研究熱點(diǎn)話題：成骨細(xì)胞凋亡，通過探討MC3T3-E1凋亡信號(hào)通路，闡述 ROS-AIF之間的關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)中，建立激素性股骨頭壞死的細(xì)胞模型，檢測(cè)ROS及AIF水平均明顯升高，再次驗(yàn)證地塞米松確實(shí)能引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，并引起成骨細(xì)胞凋亡。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）作為抗氧化劑屬于ROS抑制劑，能抑制ROS的水平和細(xì)胞凋亡[22]，NAC組檢測(cè)ROS和AIF水平均明顯降低，說明ROS和AIF之間存在一種關(guān)聯(lián)。Ca2+作為刺激AIF釋放的前提條件，在這條信號(hào)通路中起著重要作用，Ca2+通過激活鈣蛋白酶、組織蛋白酶和AIF（67kDa）使其裂解為成熟的AIF（57 kDa）形式，并通過線粒體膜 Bax/Bak調(diào)節(jié)的孔道釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與 DNA結(jié)合，發(fā)揮細(xì)胞凋亡的作用。PD151746作為選擇性的鈣蛋白酶-1的抑制劑，能有效抑制鈣蛋白酶-1的活性，抑制PARP-1和AIF的釋放，發(fā)揮抗凋亡的作用。激素組檢測(cè)ROS水平無明顯變化，AIF水平明顯降低，成骨細(xì)胞凋亡率減少。激光共聚焦檢測(cè)各組Ca2+水平，含量由高到低分別為激素組、PD組、NAC組和正常組，其他三組與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PD組、NAC組與激素組比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為Ca2+作為刺激AIF釋放的前提條件提供了有力證明。NAC能抑制該通路的 ROS，PD151746能抑制鈣蛋白酶活性，從而抑制本實(shí)驗(yàn)的重要因子Ca2+，進(jìn)而抑制AIF的釋放，NAC和PD151746都是通過該通路的因子來發(fā)揮作用的，從而推出該通路的作用（見圖7）。

圖7 本實(shí)驗(yàn)ROS/PARP-1/AIF信號(hào)通路流程圖

本實(shí)驗(yàn)建立激素性股骨頭壞死的細(xì)胞模型，檢測(cè)各試驗(yàn)組的ROS含量、Ca2+含量、AIF、PARP-1和Cyt-c的表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率，驗(yàn)證了ROS-Ca2+-PARP-1-AIF的凋亡信號(hào)通路在激素性股骨頭壞死發(fā)展中的作用，并通過抑制 ROS產(chǎn)生和鈣蛋白酶的活性，能減少成骨細(xì)胞凋亡，保護(hù)成骨細(xì)胞的作用?？傊?，本實(shí)驗(yàn)為激素性股骨頭壞死找到一條新的凋亡信號(hào)通路（ROS/PARP-1/AIF），希望能為臨床治療激素性股骨頭壞死提供一條可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。