關(guān)俊杰張解元王會(huì)黃文旵汪泱 謝宗平*

大段骨缺損的修復(fù)是骨科常見的難題。目前，異體和自體骨移植是大段骨缺損最常用的治療方法[1]。自體骨移植效果最佳，但來源有限并且獲取方法有創(chuàng)[2]。異體骨移植存在免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)，失敗率較高[3]。骨生物活性材料為大段骨缺損的治療提供了新的選擇。理想的骨生物活性材料應(yīng)該具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)活性，并且隨著新骨的不斷生成，材料逐漸降解，待材料完全降解時(shí)，新骨完全填充缺損處[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，硼酸鹽生物玻璃（borate glass,BG）具有良好的骨誘導(dǎo)性和生物相容性。BG在局部降解后可與骨組織存在密切的離子交換，并促進(jìn)礦化作用。BG的降解性和機(jī)械性能與其組分密切相關(guān)，通過改變組分含量可以顯著改變其降解速度和機(jī)械性能。由于BG具有以上生物學(xué)特性，使其成為一種具有廣闊前景的骨填充材料[5]。本研究擬比較BG與自體髂骨移植對兔橈骨干缺損的修復(fù)作用，為臨床骨缺損的修復(fù)提供更優(yōu)的生物材料。

1 材料與方法

所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行，且得到了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性清潔級新西蘭兔38只，6～8周齡，體重2.5～3kg。由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

試劑：鈣黃綠素和茜素紅購自美國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BG制備

BG制備參照以前描述的方法[6]，分子式為6Na2O-8K2O-8MgO-22CaO-54B2O3-2P2O5(mol%)。

1.2.2 動(dòng)物手術(shù)

靜脈注射戊巴比妥（30mg/kg）常規(guī)麻醉動(dòng)物，剃毛后消毒鋪巾。取左橈骨中段3cm長切口，逐層切開皮膚、淺筋膜、深筋膜和骨膜，分離暴露橈骨干。用擺鋸制造橈骨干15 mm骨缺損，整個(gè)過程中生理鹽水不斷沖洗（見圖1）?？紤]髂骨取骨植骨術(shù)是有創(chuàng)操作，可能對動(dòng)物的狀態(tài)造成影響，所有動(dòng)物都進(jìn)行髂骨取骨術(shù)，大致步驟如下：取髂前上棘附近2cm長切口，逐層切開皮膚、淺筋膜、深筋膜和骨膜，咬骨鉗咬取髂骨，骨剪剪成棒狀。根據(jù)橈骨缺損處填充的材料不同隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：空白組（n=8，缺損處無填充材料）；對照組（n=15，自體髂骨填充）；實(shí)驗(yàn)組（n=15，BG 填充）。可吸收線將材料或者自體髂骨固定缺損處，常規(guī)關(guān)閉傷口（見圖2）。術(shù)后3天碘伏常規(guī)消毒切口，肌注青霉素抗生素預(yù)防感染，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間死亡2只（空白組1只，對照組1只），均為術(shù)后行X線檢查麻醉時(shí)出現(xiàn)麻醉意外。

圖1 建立兔橈骨干中段15 mm長骨缺損模型

圖2 將BG植入骨缺損處，同時(shí)用可吸收線將材料固定于缺損處

為顯示骨缺損處新骨生成和礦化，在6周和9周分別將熒光標(biāo)記染料茜素紅（30 mg/kg）和鈣黃綠素(10 mg/kg)注射到動(dòng)物腹腔中[7]。12周后將動(dòng)物安樂死，標(biāo)本于中性福爾馬林溶液中固定48 h。

1.2.3 X線和Micro-CT檢查

術(shù)后4、8和12周后行X線檢查，評估新骨生成和材料降解情況。

將包含缺損處近端和遠(yuǎn)端各0.5 cm的標(biāo)本固定于70%的乙醇溶液中。高分辨率 Micro-CT（Skyscan 1173,比利時(shí)）來分析骨缺損處新骨生成情況。按照25 m的分辨率掃描樣本。將樣本重建并進(jìn)行3D分析，在同閾值條件下分析骨密度 (bone mineral density,BMD)和骨體積分?jǐn)?shù) (bone volume/tissue volume,BV/TV)[8]。

1.2.4 雙色熒光標(biāo)記

將樣本置于梯度乙醇中脫水后包埋于聚甲基酸甲酯(PMMA)中。硬組織包埋成功后，將樣本用硬組織切片機(jī)(Leica SP1600)以250 m的厚度進(jìn)行縱切。將硬組織切片粘在透明塑料載玻片上，并打磨至最終厚度為60m。采用共聚焦熒光顯微鏡(Leica)來檢測熒光染料在缺損處的沉積，將激發(fā)和發(fā)射光調(diào)節(jié)至543/580-670 nm和488/500-550 nm來觀察茜素紅和鈣黃綠素的沉積情況。將硬組織切片進(jìn)行 Van Gieson染色觀察新骨生成情況。

2 結(jié)果

2.1 大體照片

大體照顯示對照組和實(shí)驗(yàn)組12周后骨修復(fù)效果最好。缺損處的新生的骨形態(tài)與正常骨形態(tài)接近，BG基本降解完全。12周后空白組缺損處有少量的骨痂生成，缺損沒有骨愈合跡象（見圖3）。

圖3 取材后大體照（A.空白組；B.對照組；C.實(shí)驗(yàn)組）

2.2 X線結(jié)果

空白組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)骨缺損都沒有愈合跡象。對照組4周時(shí)有大量的骨痂生成，8周時(shí)骨痂不斷重塑，12周時(shí)完全修復(fù)骨缺損。實(shí)驗(yàn)組中BG在4周時(shí)就逐步開始降解，8周時(shí)大部分已經(jīng)降解，并有大量的骨痂生成，12周時(shí)缺損完全愈合并且支架降解完全，新生骨與正常骨的邊界模糊，髓腔重新形成并再通（見圖4）。

圖4 術(shù)后4、8和12周各組X線片

2.3 Micro-CT重建與分析

Micro-CT重建結(jié)果顯示12周后對照組和實(shí)驗(yàn)組新骨明顯多于空白組。進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)結(jié)果分析顯示對照組和實(shí)驗(yàn)組局部BMDs和BV/TV明顯優(yōu)于空白組，對照組和實(shí)驗(yàn)組之間沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖5）。

圖5 術(shù)后12周橈骨缺損處Micro-CT（A.空白組；B.對照組；C.實(shí)驗(yàn)組）和成骨分析（*P＜0.05和空白組相比，**P＜0.05和空白組相比）

2.4 礦鹽沉積和新骨生成

親骨熒光染料隨著新骨的礦化沉積在新骨生成區(qū)域，可直觀反映新骨生成情況。親骨熒光染色顯示在術(shù)后6周和9周茜素紅和鈣黃綠素沉積在對照組和實(shí)驗(yàn)組明顯多于空白組（見圖6，彩圖見插頁）。該結(jié)果顯示對照組和實(shí)驗(yàn)組新骨生成和礦化速度明顯快于空白組。

圖6 親骨熒光標(biāo)記顯示各組新骨生成和礦鹽沉積

2.5 Van Gieson染色

為進(jìn)一步顯示缺損處新骨生成情況，行VanGieson（VG）染色。VG染色結(jié)果顯示空白組有大量的纖維組織（箭頭所示），對照組和實(shí)驗(yàn)組有大量的新骨生成（*所示），并且有大量正在礦化的軟骨組織（#所示），見圖7，彩圖見插頁。VG染色結(jié)果直接證實(shí)對照組和實(shí)驗(yàn)組修復(fù)效果明顯優(yōu)于空白組。

圖7 VG硬組織染色顯示各組新骨生成情況（箭頭示膠原纖維，*示骨組織，#示軟骨組織）

3 討論

生物活性材料的出現(xiàn)為骨缺損的治療提供了新的選擇。BG作為一種生物活性玻璃，在骨缺損治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。目前尚未將BG的骨修復(fù)性能與自體骨移植這一金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較的報(bào)道?；谠缙谡n題組工作，設(shè)計(jì)了將BG的骨修復(fù)性能與自體骨移植直接進(jìn)行比較的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)BG能完全修復(fù)大段骨缺損，X線、Micro-CT、親骨熒光染色和組織學(xué)染色都顯示實(shí)驗(yàn)組新生骨明顯多于空白組，與自體髂骨移植效果接近。

理想的骨修復(fù)材料不但具有優(yōu)良骨誘導(dǎo)性能，并且還要有合適降解速度。通過X線顯示BG的降級速度與新生骨的生成速度相匹配。隨著時(shí)間的延長，BG不斷降解，同時(shí)新骨不斷生成。最終BG完全降解新骨完全填充缺損處，達(dá)到完全愈合。

研究證實(shí)，硼離子能激活多條成骨相關(guān)的通路，BG良好的骨誘導(dǎo)性與硼元素密切相關(guān)[10]。本課題組的早期研究也證實(shí)了BG通過激活BMSCs成骨相關(guān)的BMP/Smad信號(hào)通路促進(jìn)骨再生[11]。隨著植入的 BG在缺損處的降解，硼離子在缺損處發(fā)揮成骨效應(yīng)，促進(jìn)新骨生成。必須要指出的是，超過一定濃度的硼離子具有毒性。以前的研究報(bào)道兔對于硼元素的安全劑量＜100 mg/Kg。我們的血樣分析也顯示硼元素在血中的濃度遠(yuǎn)低于中毒劑量。組織學(xué)染色也沒有發(fā)現(xiàn)局部硼中毒現(xiàn)象。本研究證實(shí)BG不但能發(fā)揮良好的成骨誘導(dǎo)性能，還具有良好的生物相容性，在修復(fù)效果上達(dá)到了自體骨移植這一金標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)提示BG具有強(qiáng)大的骨誘導(dǎo)性能。因此，有必要進(jìn)一步通過大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其骨修復(fù)性能，為BG的臨床轉(zhuǎn)化奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。