李 瑩，王闊鵬，于凌嬌，劉麒，劉倩宏

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料及儀器 馬耳他布魯菌16M株(標(biāo)準(zhǔn)熱滅活)、NEB公司基因組提取試劑盒、瓊脂糖、異丙醇、70%乙醇、0.2%溴酚藍(lán)、50%蔗糖上樣緩沖液、電泳緩沖液、1 mg/mL溴化乙錠溶液(EB)、10×酶切緩沖液、Sau 3AI限制性內(nèi)切酶(NEB公司)。超聲波細(xì)胞破碎儀(新芝SCIENTZ-IID型)、電泳儀、凝膠成像儀、高速離心機(jī)、超低溫冰箱、高壓滅菌鍋、水浴鍋、穩(wěn)壓電泳儀、電泳槽、紫外檢測(cè)儀、EP管、離心管、微量移液器、量筒、燒杯、錐形瓶、吸嘴、剪刀、鑷子、塑料手套等。

1.1.2 試劑配制 氨芐青霉素(Ampicillin)配置(濃度100 mg/mL)：稱取5 gAmp，在50mL離心管加入稱好的Amp，并加入40 mL無(wú)菌水，使其充分混合溶解之后，定容到50 mL。采用規(guī)格為0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌，再分裝成小份(約1 mL/管)，在-20 ℃中保存。無(wú)菌水的制備：量取50 mL重整水，在100 mL三角瓶中加入稱量好的重整水,高壓滅菌20 min后，用高壓滅菌后的EP管分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組提取 用NEB公司基因組提取試劑盒提取馬耳他布魯菌16M株基因組，具體按試劑盒操作，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組提取結(jié)果[1-5]。

1.2.2 軟件DNAMAN分析基因組 用DNAMAN分析16M株基因組序列，識(shí)別Sau3AI酶切位點(diǎn)，預(yù)測(cè)該酶可能的酶切片段大小[6]。

1.2.3 Sau3AI酶切基因組 根據(jù)Sau3AI酶的使用說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行如下操作：

(1)在0.5mLEP管中,建立基因組DNA酶解的混合體系；并將混合物置于55 ℃水浴中，水浴15 min,使基因組DNA片段被分散。

10×Sau3AI緩沖液 5 μL

提取的基因組DNA 20 μL(25-60 μg)

無(wú)菌重整水 75 μL

共100 μL。

(2)將(1)中液體分裝在5個(gè)Ep管中(Ep管需要標(biāo)記數(shù)字1、2、3、4、5，便于區(qū)分),其中1管為30 μL,2管-4管各為20 μL,5管為10 μL。5個(gè)Ep管冰浴放置。

(3)根據(jù)3-10 U/μgDNA的量，加入Sau3AI酶于1管,輕輕彈動(dòng)管壁，利于二者混勻,短暫離心2s后，收集反應(yīng)物,并在冰上放置。

(4)用微量移液器在1管中吸取10 μL液體放入到2管中,立刻混勻,混勻后放置在冰上。

(5)梯度稀釋。在2管中，用移液器取10 μL液體到3管,在3管中取10 μL液體至4管,4管10 μL液體到5管。注意：連續(xù)稀釋后,每管體積都是20 μL。

(6)在37 ℃時(shí)，保溫20 min,然后在68 ℃水浴鍋中水浴5-8 min,使Sau3AI內(nèi)切酶失活,在冰上放置。

(7)在各酶解產(chǎn)物管中分別取4 μL，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),大約電泳5-16 h,判斷酶解產(chǎn)物的大小范圍[7]。

1.2.4 超聲裂解法打斷基因組 利用超聲波細(xì)胞破碎儀(新芝SCIENTZ-IID型)隨機(jī)打斷布魯菌基因組[8-9]。超聲條件設(shè)定見(jiàn)表1。

表1 超聲組別

1.2.5 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 利用電泳檢測(cè)兩種方法隨機(jī)打斷基因組情況。

(1)制備1%瓊脂糖凝膠：稱取0.5 g瓊脂糖，放在錐形瓶中，加一倍濃度的電泳緩沖液(1X電泳緩沖液)，輕輕晃動(dòng)幾下，用微波爐加熱，使融化均勻。加熱之前，錐形瓶口要密封，減少在加熱過(guò)程中水分的蒸發(fā)。

(2)制備膠板：把膠槽放到制膠板上，插上梳子，注意梳子齒末端與膠槽底部保留大約1 mm距離。等到凝膠溶液冷卻到50 ℃時(shí)，加濃度為0.5 μL/mL的EB，輕輕地?fù)u勻，慢慢將其倒入到制膠板中，要注意消滅氣泡。等到凝膠冷卻凝固后，將梳子拔出。將凝膠放入到電泳槽內(nèi)，加1X電泳緩沖液，使緩沖液液面比瓊脂糖凝膠面高一點(diǎn)點(diǎn)。

(3)加樣：把樣品DNA和樣品緩沖液混合在點(diǎn)樣板上，用10 μL微量移液器取樣加在樣品槽中，每次加樣都要更換槍頭，防止污染，影響結(jié)構(gòu)。加樣時(shí)要小心謹(jǐn)慎，勿觸碰樣品孔周圍，記住加樣順序、加樣量。注意：樣品緩沖液不小于1X。

(4)電泳：加樣后，應(yīng)立刻通電進(jìn)行電泳。樣品從黑色負(fù)電極移動(dòng)至紅色正電極。當(dāng)溴酚藍(lán)移至距離膠板下緣1 cm處時(shí)，停止電泳。

(5)拍照觀察：電泳后取出凝膠。在波長(zhǎng)為254 nm的紫外線下，觀察電泳膠板?？梢钥吹皆贒NA存在的位置，有橘紅色條帶。用凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存。

圖1 布魯菌基因組1.Marker從上到下大小依次為100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，1 500 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp，10 000 bp；2.馬爾他布魯菌16M株DNA提取結(jié)果

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 馬耳他布魯菌16M基因組提取結(jié)果

用NEB公司基因組提取試劑盒提取布魯菌16M基因組，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示提取基因組成功，且DNA提取濃度較高；經(jīng)OD260/280分析，基因組純度也達(dá)到要求。

2.2 軟件分析結(jié)果

Sau3AI 識(shí)別酶切位點(diǎn)為GATC。軟件預(yù)測(cè)布魯菌16M株基因組(NC_003317.1) 經(jīng)Sau3AI酶切圖譜如圖2。結(jié)果表明布魯菌16M株基因組上有Sau3AI酶的酶切位點(diǎn)，且經(jīng)酶切后得到的線性DNA片段大小分別為30 bp,42 bp,120 bp, 127 bp,267 bp,503 bp;得到的環(huán)形DNA片段大小分別為30 bp,42 bp,120 bp,127 bp,770 bp。

酶切后得到線性DNA片段為30 bp,42bp,120bp,127bp,267bp,503bp;得到的環(huán)形DNA為30 bp,42 bp,120 bp,127 bp,770 bp。

圖2 Sau3AI酶切位點(diǎn)圖

圖3 酶切法打斷基因組1.Marker 從上到下大小依次為100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，1 500 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp，10 000 bp；2-3.Sau3AI酶切基因組結(jié)果

圖4 超聲法打斷基因組1.Marker 從上到下大小依次為100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，1 500 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp，10 000 bp；2.超聲30下；3超聲20下；4.Marker；5.超聲10下

2.3 酶切法隨機(jī)打斷基因組結(jié)果

Sau3AI酶切馬耳他布魯菌16M株基因組，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明酶切的基因片段比較小，并且分布均勻。

2.4 超聲法隨機(jī)打斷基因組結(jié)果

采用3組不同超聲裂解條件，對(duì)16M株基因組隨機(jī)打斷，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明輸出功率50% ,超聲3s,間隔3s,超聲次數(shù)為10下，效果最好。

2.5 基因組打斷效果檢測(cè)分析

本試驗(yàn)的目的是為了建立布魯菌基因組隨機(jī)文庫(kù)，通過(guò)用Sau3AI酶切和超聲破碎基因組，得到想要的基因片段，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。所需基因片段大小約為200-3 000 bp之間，片段均勻，大小適中。而通過(guò)電泳檢測(cè)可知，酶法得到的基因片段大多數(shù)都是小片段，超聲法得到的片段為一條抹帶，范圍在200-3 000 bp，符合后續(xù)試驗(yàn)需要。

3 分析與討論

利用超聲法處理基因組具有設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，樣品損失少，處理速度快，有利于分離純化，具有良好的通透性，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、自動(dòng)化，樣品處理量大，成本低，轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)。酶法顯著的特點(diǎn)是專一性強(qiáng)，樣品處理速度快，比較溫和，并且能夠更好的保留DNA完整性以及蛋白質(zhì)的抗原表位。

超聲法對(duì)DNA的打斷是隨機(jī)的，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較高。對(duì)于那些與DNA結(jié)合不緊密的蛋白或低豐度表達(dá)的蛋白，如調(diào)控因子、轉(zhuǎn)錄因子等通常需要用交聯(lián)試劑固定樣本(細(xì)胞或組織)以穩(wěn)定蛋白質(zhì)和DNA的形態(tài)，這種情況最好用超聲法。如果樣本無(wú)需交聯(lián)，例如研究對(duì)象是與DNA結(jié)合緊密的蛋白或高豐度表達(dá)的蛋白，那么便可以使用酶法。但酶切法得到的DNA片段相對(duì)較短，不適合染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)及與芯片方法的結(jié)合(CHIP-Chip)實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序(CHIP-Seq)實(shí)驗(yàn)。

研究擬利用隨機(jī)打斷的基因組DNA片段構(gòu)建布魯菌16M株隨機(jī)文庫(kù)，基因組DNA片段的質(zhì)量(包括片段的濃度、大小等)直接決定構(gòu)建文庫(kù)的多樣性及隨機(jī)性。因此，本研究比較了酶切法和超聲法對(duì)基因組DNA的隨機(jī)打斷效率，并對(duì)超聲法裂解基因組DNA進(jìn)行了條件優(yōu)化，為后續(xù)隨機(jī)文庫(kù)構(gòu)建你奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)通過(guò)比較超聲法和酶切法隨機(jī)打斷布魯菌16M株基因組效果，為后續(xù)建庫(kù)奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，超聲法(輸出功率50% ,超聲3 s,間隔3 s,超聲次數(shù)10下)效果更好。