趙 宏，李 斌，劉 燕，王樹(shù)林，趙 磊，王秀娟

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，西寧 810001)

缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia indu-cible factor 1α，HIF-1α) 屬于核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)機(jī)體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)起維持作用。HIF-1α可調(diào)控機(jī)體內(nèi)100多種基因的表達(dá)[1]。在心臟疾病中，心肌均存在不同程度的缺血、缺氧，HIF-1α表達(dá)的增加是機(jī)體適應(yīng)心肌缺血缺氧產(chǎn)生的代償，可激活細(xì)胞膜上的酸敏感因子通道，造成心肌缺血損傷等[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可有效促進(jìn)血管生成，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)缺血性心臟病有積極治療作用[3]。有研究證實(shí)Se-Met對(duì)缺氧大鼠血管活性物質(zhì)有影響[4]，可以改善缺氧損傷。本研究擬探討慢性低氧條件下，補(bǔ)Se-Met對(duì)大鼠血漿HIF-1α、VEGF水平的影響，以及對(duì)大鼠心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠90只，SPF級(jí)，體重200 g左右，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SCXK(甘)2015-0002]。

1.1.2 試劑儀器

ELISA試劑盒由上海華壹生物科技有限公司提供。多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司，型號(hào)為Infinite M200 PRO。低壓氧艙購(gòu)自貴州風(fēng)雷航空機(jī)械有限公司，型號(hào)為DYC-3000。透射式電子顯微鏡購(gòu)自日本日立(HITACHI)公司， 型號(hào)為H-7650。超薄切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，型號(hào)為UC7。

1.2 研究方法

1.2.1 硒代蛋氨酸添加方法

硒代蛋氨酸添加量按照成年人每日硒的參考攝入量(60μg/d)進(jìn)行折算，分成3個(gè)劑量組，第1組飼料中硒加入量為參考攝入量的5倍，第2組為10倍，第3組為20倍。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組方法

SD大鼠分成9組(每組10只)。根據(jù)不同海拔(3000m和5000m)設(shè)組，每個(gè)海拔再分成4組：低氧3 000 m對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)30組)、第1組(簡(jiǎn)稱(chēng)31組)、第2組(簡(jiǎn)稱(chēng)32組)、第3組(簡(jiǎn)稱(chēng)33組)；低氧5 000 m對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)50組)、第1組(簡(jiǎn)稱(chēng)51組)、第2組(簡(jiǎn)稱(chēng)52組)、第3組(簡(jiǎn)稱(chēng)53組)；同時(shí)設(shè)常氧對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)00組)。

對(duì)照組喂飼普通飼料，加硒組喂飼不同劑量加硒飼料。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

將大鼠分別置入模擬海拔3 000 m和5 000 m的低壓低氧艙30 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取大鼠血(經(jīng)腹主動(dòng)脈)及內(nèi)臟，血液放入EDTA抗凝管內(nèi)，離心(3000r/min，10min)，血漿及心臟置液氮保存。采用ELISA法測(cè)定大鼠血漿HIF-1、VEGF水平。采用電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體改變，動(dòng)物處死后取心肌組織切成1 mm3的小塊，立即置于2.5%的戊二醛固定液中(4℃)固定2小時(shí)以上，用0.1 M磷酸緩沖液浸洗30 min、1%四氧化鋨固定液4 ℃后固定2小時(shí)、乙醇梯度脫水、還氧丙烷置換10 min、環(huán)氧樹(shù)脂Epon812浸透包埋，在聚合后做半超薄切片(1～2μ)、美蘭染色后在光學(xué)顯微鏡下定位，用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片(50～70nm)，用醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，在透射式電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較用方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組低氧大鼠血漿HIF-1α水平比較

對(duì)00組、30組、50組進(jìn)行總體及兩兩比較，P<0.05，3個(gè)對(duì)照組間差異有顯著性，說(shuō)明慢性低氧對(duì)HIF-1α水平有影響。海拔3 000 m的4個(gè)組間比較，F(xiàn)=4.254，P<0.005。30組與32組(P=0.015)、31組與32組(P=0.002)、32組與33組(P=0.041)的差異均有顯著性(P<0.05)。低氧對(duì)照組HIF-1α水平高于補(bǔ)硒各組，補(bǔ)硒降低了HIF-1α水平，以32組下降明顯。海拔5 000 m的4組間比較，F(xiàn)=4.165，P<0.005。50組與52組(P=0.017)、51組與52組(P=0.004)、51組與53組(P=0.039)的差異均有顯著性(P<0.05)。低氧對(duì)照組HIF-1α水平高于補(bǔ)硒各組，補(bǔ)硒降低了HIF-1α水平，以53組下降明顯。不同海拔組間可見(jiàn)HIF-1α水平隨補(bǔ)硒量的增加而降低，5 000 m補(bǔ)硒各組下降明顯(表1)。

表1不同海拔低氧大鼠血漿HIF-1α、VEGF水平(ng/L)

Table 1Plasma HIF-1α and VEGF levels at different altitudes in hypoxic rats(ng/L)

2.2 各組低氧大鼠血漿VEGF水平比較

對(duì)00組、30組、50組總體比較，P<0.05，3個(gè)對(duì)照組間差異有顯著性，說(shuō)明慢性低氧對(duì)VEGF水平有影響。海拔3 000 m組間比較，補(bǔ)硒各組VEGF水平均低于對(duì)照組，隨補(bǔ)硒量增加而降低。海拔5 000 m組間比較，50組與52組(P=0.041)、51組與53組(P=0.048)、52組與53組(P=0.013)的差異均有顯著性，補(bǔ)硒組VEGF水平高于對(duì)照組。不同海拔組VEGF水平均低于常氧對(duì)照組，VEGF水平隨補(bǔ)硒量增加而降低(表1)。

2.3 00組、50組、52組低氧大鼠心肌細(xì)胞線粒體改變(圖1)

00組 ×10000 50組 ×10000 52組 ×10000

圖1示，00組大鼠心肌細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核形狀多不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻；肌原纖維排列基本整齊，肌節(jié)基本完整；肌原纖維間線粒體豐富，線粒體體積較大，嵴密集。50組大鼠心肌細(xì)胞核形狀不規(guī)則；肌原纖維間線粒體腫脹明顯，線粒體嵴間隙增寬，部分線粒體嵴溶解成空泡狀；部分肌原纖維排列不整。52組大鼠心肌細(xì)胞核形狀多不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，肌原纖維排列基本整齊，肌原纖維間線粒體腫脹程度明顯減輕。補(bǔ)硒組大鼠心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)明顯接近于常氧對(duì)照組，對(duì)慢性低氧大鼠補(bǔ)充Se-Met明顯減輕了低氧對(duì)心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響。

3 討論

HIF-1α對(duì)機(jī)體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)起維持作用，可與其他信號(hào)通路形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，在細(xì)胞增殖、血管形成與重塑等方面發(fā)揮著重要作用[1]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)照組大鼠血漿HIF-1α水平明顯高于常氧對(duì)照組，HIF-1α水平在低氧條件下上升，不同海拔各組大鼠飼料中補(bǔ)充硒代蛋氨酸后HIF-1α水平有不同程度下降，在3 000 m和5 000 m組均以中硒劑量組(32組，52組)HIF-1α水平下降明顯。

HIF-1α能保護(hù)缺氧心肌，但其過(guò)度、持續(xù)激活會(huì)惡化心功能，導(dǎo)致心肌肥厚。心臟特異性過(guò)表達(dá)HIF-1α?xí)档图≠|(zhì)網(wǎng)鈣-ATP酶蛋白，導(dǎo)致患者發(fā)生心肌??；持續(xù)增加的HIF-1α也會(huì)降低缺血性心臟病患者的心功能[5]。李永旺[6]認(rèn)為，HIF-1α在動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)所致的氧化應(yīng)激的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，抑制HIF-1α的表達(dá)能減輕心力衰竭患者全身的炎癥反應(yīng)，改善血管內(nèi)細(xì)胞的功能狀態(tài)。因此慢性低氧條件下適當(dāng)補(bǔ)充硒代蛋氨酸能夠有效降低HIF-1α水平，減少缺氧條件下持續(xù)增加的HIF-1α對(duì)心臟組織造成的損害。

VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂源，低氧后VGEF表達(dá)的上調(diào)具有重要的病理生理意義[7]。本研究發(fā)現(xiàn)不同海拔各組大鼠飼料中補(bǔ)充硒代蛋氨酸后VGEF水平有不同程度下降，在3 000 m和5 000 m組均以高硒劑量組(33組，53組)VGEF水平下降最為明顯。侯文艷等[8]發(fā)現(xiàn)，VEGF促進(jìn)新血管形成，作用于肺小動(dòng)脈內(nèi)膜后，引起內(nèi)膜增厚及介導(dǎo)新血管形成，肺動(dòng)脈壓力升高后，增加了右室后負(fù)荷而影響了心臟的結(jié)構(gòu)和功能。同時(shí)，HIF-1α可以通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管生成[9]。慢性低氧條件下通過(guò)補(bǔ)充硒代蛋氨酸能夠降低VGEF水平或通過(guò)減少HIF-1α來(lái)調(diào)節(jié)VGEF水平，減少了肺動(dòng)脈高壓發(fā)生，進(jìn)而減少了對(duì)心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響。

線粒體是真核細(xì)胞產(chǎn)生ATP，進(jìn)行能量代謝的重要場(chǎng)所。心肌細(xì)胞持續(xù)不斷地收縮舒張，需要消耗大量的能量，線粒體的分布、形態(tài)變化以及數(shù)量的改變不僅是其保持自身功能穩(wěn)定性的基礎(chǔ)，還在保持細(xì)胞正?；顒?dòng)中扮演著非常重要的角色[10]。本研究通過(guò)電鏡觀察各組大鼠心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)硒組大鼠心肌細(xì)胞線粒體的形態(tài)接近于常氧對(duì)照組，對(duì)慢性低氧大鼠補(bǔ)充Se-Met明顯減輕了低氧對(duì)心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響，改善了心肌細(xì)胞的能量供應(yīng)，降低了低氧對(duì)心臟功能的影響。