楊 宇，任 利，2#，張靈強(qiáng)，2，樊海寧，2，王海久，2 ，陽(yáng)丹才讓?zhuān)?，張耀剛

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，西寧 810001；2.青海省包蟲(chóng)病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001)

泡球蚴與宿主之間產(chǎn)生著復(fù)雜的免疫反應(yīng)，探究體內(nèi)的炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平有助于揭示泡球蚴與宿主相互作用的關(guān)系以及疾病的進(jìn)展情況。

IL-37是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的抗炎因子，歸屬于IL-1類(lèi)家族，目前尚未見(jiàn)到IL-37在泡型包蟲(chóng)病中的研究報(bào)道。本研究選取IL-37以及與其相關(guān)的細(xì)胞因子IL-18、IL-18BP，探討它們?cè)谂菪桶x(chóng)病(alveolar echinococcosis，AE)患者血漿中的表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 泡型包蟲(chóng)病患者

選取青海大學(xué)附屬醫(yī)院2017年9月～2018年2月間入院的泡型包蟲(chóng)病患者21例，男10例，女11例，平均年齡(41.38±12.06)歲。所有患者均符合2015版《肝兩型包蟲(chóng)病診斷與治療專(zhuān)家共識(shí)》所示診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)合并囊型包蟲(chóng)病患者；2)合并嚴(yán)重感染者；3)合并病毒性肝炎、自身免疫性疾病、腫瘤者；4)長(zhǎng)期服用非甾體抗炎藥物者。

1.1.2 健康對(duì)照者

選取同期在青海大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的健康志愿者25例，男12例，女13例，平均年齡(41.08±12.02)歲。兩組在年齡、性別等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究已通過(guò)院倫理委員會(huì)審查，且所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集

用EDTA管收集受試者晨起空腹外周靜脈血5 mL，離心(3500r/min)10 min后取上層血漿檢測(cè)。

1.2.2 試劑、儀器選擇

運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血漿中IL-37、IL-18、IL-18BP的表達(dá)水平(ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)；使用酶標(biāo)儀(BIO-RAD 680，美國(guó))檢測(cè)吸光度(450nm)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立直線回歸方程，再根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算出其相對(duì)應(yīng)的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿IL-37、IL-18、IL-18BP表達(dá)水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，AE患者血漿中IL-37、IL-18、IL-18BP的水平均高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

Table 1Expression of IL-37，IL-18，IL-18BP in two

AE：泡型包蟲(chóng)病患者組；HC：健康對(duì)照組

2.2 AE組患者血漿中IL-37、IL-18、IL-18BP三種因子間的相關(guān)性

相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，AE組患者血漿IL-37表達(dá)量與IL-18(r=0.513，P=0.018)、IL-18BP(r=0.574，P=0.010)呈正相關(guān)；IL-18與IL-18BP(r=0.612，P=0.003)也呈正相關(guān)。見(jiàn)圖1。

圖1IL-37、IL-18、IL-18BP三種細(xì)胞因子間的相關(guān)性分析圖

Figure1CorrelativeanalysisamongIL-37，IL-18andIL-18BP

2.3 AE組患者血漿IL-37、IL-18、IL-18BP與肝功能指標(biāo)相關(guān)性

相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，AE組患者血漿三種細(xì)胞因子表達(dá)量均與ALT、AST呈正相關(guān)。見(jiàn)圖2。

圖2三種細(xì)胞因子與ALT、AST相關(guān)性分析圖

Figure2CorrelativeanalysisamongthreecytokinesandALTandAST

2.4 IL-37、IL-18、IL-18BP在不同肝功能Child分級(jí)的AE患者中的表達(dá)結(jié)果

相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，AE患者中，IL-37、IL-18、IL-18BP在肝功能Child評(píng)分A級(jí)患者低于肝功能Child評(píng)分B～C級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

Table 2Expression of IL-37，IL-18 and IL-18BP in AE patients with different liver

2.5 IL-37、IL-18、IL-18BP在有血管侵犯組與無(wú)血管侵犯組AE患者中的表達(dá)結(jié)果

根據(jù)CT影像學(xué)資料，將AE患者分為血管侵犯組和無(wú)血管侵犯組，結(jié)果顯示存在血管侵犯組患者血漿IL-37、IL-18、IL-18BP表達(dá)量高于無(wú)血管侵犯組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

Table 3Expression of IL-37，IL-18，IL-18BP in vascular invasion group and non-vascular invasion group of AE

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)AE患者外周血IL-37的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組。提示IL-37與泡型包蟲(chóng)病的發(fā)展具有一定的相關(guān)性。IL-37分子量約為17～25 kDa，是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的抗炎因子。IL-37在正常機(jī)體中低表達(dá)，但有炎癥時(shí)表達(dá)升高，具有抑制固有免疫、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用[1]。

IL-18是一類(lèi)促炎因子，歸屬于IL-1類(lèi)家族，由多種免疫細(xì)胞分泌[2]。IL-18作用于NK細(xì)胞及Th1細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的抗寄生蟲(chóng)作用[3]。IL-18BP是IL-18的天然拮抗劑，能夠和IL-37結(jié)合形成復(fù)合物，增強(qiáng)了對(duì)IL-18引起的一系列炎癥反應(yīng)的抑制。在本研究，我們發(fā)現(xiàn)AE患者血漿IL-18、IL-18BP的表達(dá)量均高于健康對(duì)照組，且IL-37含量與IL-18、IL-18BP含量呈正相關(guān)。

此外，我們?cè)谌N細(xì)胞因子與肝功能相關(guān)生化指標(biāo)分析中發(fā)現(xiàn)，AE患者血漿中的AST、ALT表達(dá)水平與三種細(xì)胞因子呈正相關(guān)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)Child A級(jí)患者三種細(xì)胞因子的表達(dá)量低于Child B～C級(jí)的患者。劉晶晶[4]、黃太宏[5]等在乙肝的研究中也發(fā)現(xiàn)乙型肝炎患者血漿IL-37表達(dá)量與ALT呈正相關(guān)。Li等[6]的研究表明IL-37與肝損傷具有一定的關(guān)聯(lián)，并指出IL-37能抑制炎性肝損傷。Sakai等[7]研究發(fā)現(xiàn)IL-37是通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞的作用降低肝損傷。有研究發(fā)現(xiàn)IL-18表達(dá)量的升高能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞膜表面Fas以及部分淋巴細(xì)胞膜表面FasL的高表達(dá)，淋巴細(xì)胞FasL與肝細(xì)胞Fas結(jié)合直接引起肝細(xì)胞凋亡[8～11]。同時(shí)，IL-18能通過(guò)誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生(如INF-γ、TGF-α等)而造成肝損傷[12，13]。基于上述理論，我們推測(cè)AE蟲(chóng)體寄生于人體肝臟，引起包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞[14]在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞的活化，活化的免疫細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)，如TGF-α、INF-γ、IL-18、IL-2等，一方面對(duì)寄生的蟲(chóng)體形成殺傷作用，另一方面也造成了肝細(xì)胞的炎癥性損傷。IL-18、IFN-γ、TGF-α等促炎因子能夠反饋性地引起IL-18BP、IL-37的表達(dá)升高[15]。同時(shí)，損傷的肝細(xì)胞也能間接地使IL-37的表達(dá)上調(diào)[6]，防止免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)對(duì)人體造成損傷。

泡型包蟲(chóng)病具有血管侵犯的特性。本研究發(fā)現(xiàn)，有血管侵犯的AE患者血漿IL-37、IL-18、IL-18BP的表達(dá)量高于無(wú)血管侵犯組AE患者。IL-37、IL-18與血管生成調(diào)節(jié)相關(guān)。Yang等[16]發(fā)現(xiàn)IL-37是一種新型的促血管生成因子，并推測(cè)IL-37可能是通過(guò)激活ERK1/2以及 AKT信號(hào)通路而引起血管生成。但多數(shù)關(guān)于腫瘤的研究則認(rèn)為，IL-37能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移及血管的生成。IL-37在泡型包蟲(chóng)病血管生成調(diào)節(jié)中究竟扮演什么樣的角色尚不得而知，有待進(jìn)一步的研究。Nagai[17]、Tasaki[18]等證實(shí)IL-18能夠抑制血管生成。同時(shí)，我們還推測(cè)AE蟲(chóng)體對(duì)血管造成損傷后，蟲(chóng)體釋放的生物活性物質(zhì)[14]也隨之進(jìn)入血液，打破了原本的寄生蟲(chóng)免疫逃逸與宿主免疫攻擊的平衡狀態(tài)，使機(jī)體再次產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而引起IL-18、IL-37、IL-18BP表達(dá)量升高。

近些年來(lái)，隨著對(duì)IL-37研究的深入，IL-37對(duì)Treg細(xì)胞的活化[19，20]、M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[21，22]等均有影響，而這些因素的產(chǎn)生，使得人體免疫處于抑制狀態(tài)，是AE蟲(chóng)體躲避人體免疫攻擊的重要一環(huán)。

在AE的發(fā)病的過(guò)程中，蟲(chóng)體與宿主之間發(fā)生了復(fù)雜的免疫反應(yīng)。研究免疫因子有利于揭示疾病的發(fā)展進(jìn)程、尋找疾病發(fā)生可能的信號(hào)通路、探尋潛在的治療靶點(diǎn)。本項(xiàng)目研究了三種細(xì)胞因子表達(dá)量與AE患者病情間的關(guān)系，但樣本量較少，代表性不足，且缺乏對(duì)其表達(dá)細(xì)胞及信號(hào)通路的研究，有待后續(xù)研究者做更深層次的探討。

綜上所述，泡型包蟲(chóng)病患者體內(nèi)IL-37、IL-18、IL-18BP的表達(dá)高于健康對(duì)照組。同時(shí)，三種細(xì)胞因子的表達(dá)量與病情嚴(yán)重程度可能相關(guān)。具體的作用機(jī)制目前尚不清楚，有待后續(xù)研究。