陳 婷 王怡坤 俞如旺

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350117)

“分解纖維素的微生物的分離”是人教版高中教材選修1中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)，包括土壤取樣、選擇性培養(yǎng)纖維素分解菌、菌懸液的濃度梯度稀釋、涂布平板法分離細(xì)菌、纖維素分解菌的觀察與鑒定等步驟。本文對(duì)該實(shí)驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行一些細(xì)節(jié)補(bǔ)充，能夠有效地提高該實(shí)驗(yàn)的成功率，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生對(duì)微生物的分離、培養(yǎng)與鑒別能力。

1 土壤取樣

收集富有纖維素分解菌的土壤樣品，應(yīng)選擇纖維素豐富的土質(zhì)。如花盆土、多年積累的枯枝敗葉、腐殖土等[1]。具體操作： 在校園中選擇落葉豐富的區(qū)域，撥開(kāi)樹(shù)葉，用小鏟取葉下腐殖質(zhì)豐富的土壤。在報(bào)紙上將土壤碾碎，并用鑷子取出土壤中較大的沙石、樹(shù)葉、樹(shù)根、蟲(chóng)卵等物質(zhì)，將剩余土壤放入無(wú)菌袋中備用。需注意的是： 選取土壤樣本時(shí)切勿選用過(guò)于疏松，含大量樹(shù)葉、樹(shù)根的土壤。因?yàn)?，此?lèi)土壤在搖床培養(yǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)大量碎屑，影響菌懸液濃度梯度稀釋過(guò)程中的菌液采集。

如若校園中無(wú)法找到合適的、富有纖維素的土壤，也可以將濾紙埋在約10cm深的土壤處，一段時(shí)間后即可獲得具有分解纖維素能力的大量微生物。人教版高中教材選修1中提及： 將濾紙埋在土壤中，30d左右能夠從濾紙中獲取大量纖維素分解菌。但筆者利用校園環(huán)境，將濾紙埋在夏季溫暖、濕潤(rùn)的校園花園中，僅需7d左右便可從濾紙上獲取大量纖維素分解菌。

2 選擇性培養(yǎng)纖維素分解菌

利用纖維素分解菌的選擇性培養(yǎng)基，可使土壤混合菌落中的纖維素分解菌成為優(yōu)勢(shì)種群，從而在液體培養(yǎng)基中大量富集。具體操作： 按照纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方配置30mL的培養(yǎng)基倒入錐形瓶中，封口后在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。在無(wú)菌環(huán)境下，稱(chēng)取6～10g土壤于選擇性培養(yǎng)基中，置于30℃、250rpm的搖床培養(yǎng)1d左右至培養(yǎng)基變混濁，取上層懸液備用。

但筆者經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)得出，忽略選擇性培養(yǎng)纖維素分解菌這一步驟，直接將土壤溶于生理鹽水中，制備菌原液能夠獲得更好的實(shí)驗(yàn)效果。其原因有二： ①選擇性培養(yǎng)纖維素分解菌的過(guò)程易受培養(yǎng)時(shí)間、溫度等因素影響；②過(guò)度培養(yǎng)土壤懸液中的各種細(xì)菌，會(huì)導(dǎo)致選擇性培養(yǎng)基中菌量過(guò)大，反而造成培養(yǎng)基中含氧量降低、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少等結(jié)果，最終影響土壤中纖維素分解菌的菌種豐富度。

因此，若忽略選擇性培養(yǎng)纖維素分解菌后，將土壤溶解于生理鹽水中，可制備土壤樣品在生理鹽水中的菌懸液。具體操作： 將6g土壤樣品加入30mL生理鹽水中，置于30℃、 250rpm的搖床上，振蕩培養(yǎng)0.5～1h左右，取上層懸液備用。該操作能夠使土壤中的各種微生物充分溶于生理鹽水，提取出較為原始的土壤菌群。

3 菌懸液的濃度梯度稀釋

選擇性培養(yǎng)基制備的菌懸液中菌濃度極高，若以其作為母液，直接接種于鑒別性培養(yǎng)基上，會(huì)導(dǎo)致鑒別性培養(yǎng)基中菌的分布過(guò)于密集，從而出現(xiàn)菌落重疊的現(xiàn)象，不利于后續(xù)的觀察。因此，在實(shí)際操作中應(yīng)以選擇性培養(yǎng)基中的菌液或生理鹽水中的菌液作為菌原液，進(jìn)行密度梯度稀釋。該操作可以有效降低培養(yǎng)基中的菌數(shù)，便于培養(yǎng)出單菌落，從而進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。具體操作： 取一支試管，加入9mL生理鹽水和1mL菌懸液并搖勻，制成濃度為10-1菌懸液；在濃度為10-1菌懸液中取1mL懸液加入另一支裝有9mL生理鹽水的試管中并搖勻，制成濃度為10-2菌懸液。按照上述操作，可依次制備出10-1～10-6濃度梯度的菌懸液。富集培養(yǎng)后的菌懸液一般需要將濃度稀釋至10-2～10-4，才能容易將菌落分散開(kāi)，出現(xiàn)清晰的單一菌落；而未富集培養(yǎng)的菌懸液一般是將菌懸液濃度稀釋至10-2～10-3最為適宜。

值得注意的是，筆者在實(shí)驗(yàn)操作中兩次以無(wú)菌生理鹽水取代教材中提及的無(wú)菌水，進(jìn)行土壤樣品溶解、制備菌原液及菌懸液的濃度梯度稀釋等步驟。原因在于： 生理鹽水不僅是人體細(xì)胞的等滲液，也是細(xì)菌細(xì)胞的等滲液，能夠維持細(xì)菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，使其保持生命活性。并且生理鹽水能夠?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞的生命活動(dòng)提供所需的無(wú)機(jī)鹽，有利于細(xì)菌生長(zhǎng)。

4 涂布平板法分離菌株

采用涂布平板法將稀釋后的菌懸液接種至鑒別培養(yǎng)基中，能夠使懸液中的菌均勻地分散在培養(yǎng)基上，便于對(duì)纖維素分解菌的觀察、鑒別、計(jì)數(shù)與挑選。具體操作： 將制備好的菌懸液搖勻后，選擇濃度適宜的菌懸液進(jìn)行涂布平板。在無(wú)菌條件下，用移液槍取0.1mL菌懸液至瓊脂固體培養(yǎng)基中，并用涂布棒將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基上，室溫放置2～3min，使菌液完全被培養(yǎng)基吸收。用封口膜封口，將培養(yǎng)基倒置在30℃左右的恒溫箱中培養(yǎng)1～2d即可。培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)，可以防止在培養(yǎng)菌的過(guò)程中產(chǎn)生的水滴落到培養(yǎng)基上，沖散菌落。

若條件允許，可在接菌前，預(yù)先倒好培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，將其倒扣并置于32℃左右的恒溫箱中烘干2～3h。該做法能有效減少培養(yǎng)基中的水分，使菌液更快被培養(yǎng)基吸收，避免培養(yǎng)基染菌或出現(xiàn)水痕。

5 纖維素分解菌的觀察與鑒定

快速鑒別纖維素分解菌的方法有很多，其中剛果紅染色法是目前比較常用的一種鑒別的方法[2]。剛果紅能夠與纖維素形成紅色復(fù)合物，因此可用其鑒定纖維素或纖維素分解菌。將剛果紅加入固體培養(yǎng)基中，剛果紅與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物，因此培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色；含有纖維素分解菌的菌落，由于纖維素分解菌分解其周?chē)w維素，因此其周?chē)睦w維素含量較低或無(wú)纖維素的存在，則菌落周?chē)鸁o(wú)紅色復(fù)合物形成，因而出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈。其中，常用的剛果紅染色法有兩種，具體操作如下：

方法一： 將適量的剛果紅加入尚未凝固的培養(yǎng)基中，充分溶解，可配置出纖維素分解菌的鑒別性培養(yǎng)基。再進(jìn)行菌落接種的培養(yǎng)，從而觀察單一菌落周?chē)囵B(yǎng)基的情況。為使纖維素分解菌周?chē)耐该魅Ω子^察，須將培養(yǎng)基置于白色背景，如白色硬紙板前；并適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)觀察角度，可明顯觀察到部分菌落周?chē)嬖谕该魅?。調(diào)節(jié)剛果紅的濃度，使其在培養(yǎng)基中的濃度適當(dāng)，能更容易觀察到透明圈。經(jīng)筆者反復(fù)實(shí)驗(yàn)、比較得出，當(dāng)剛果紅在培養(yǎng)基中的濃度約為0.3g/L時(shí)，培養(yǎng)基既能保持一定透明度，又能和透明圈出現(xiàn)明顯色差。

方法二： 先在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌群，待菌落長(zhǎng)出，加入適量1mol/L的剛果紅溶液染色，等待15min后倒去培養(yǎng)皿內(nèi)的剛果紅與浮起的菌落。再加入適量1mol/L的NaCl溶液漂洗一次，洗去浮色。

比較兩種方法，以方法一進(jìn)行纖維素分解菌的觀察與鑒定能更容易觀察到菌落的實(shí)際大小、形態(tài)。以方法二進(jìn)行纖維素分解菌的觀察與鑒定雖然可以在培養(yǎng)基上觀察到較為明顯的透明圈，但形態(tài)結(jié)構(gòu)較為光滑的細(xì)菌染色、漂洗過(guò)程中容易浮起并被帶走，因此不利于菌落的形態(tài)的觀察，難以保留菌種。

(基金項(xiàng)目： 教育部人文社會(huì)科學(xué)研究規(guī)劃基金項(xiàng)目“核心素養(yǎng)導(dǎo)向的科學(xué)課程高中學(xué)業(yè)水平考試實(shí)施策略與命題研究”，No.17YJA880088;*通信作者)