朱海珍 黃湘 王靜靜 許艷 陳瑾文 王鑫濤

摘? ?要：新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）是一種復(fù)制能力較強(qiáng)且特異性識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的禽類病毒. 肝癌細(xì)胞被NDV感染后，會(huì)特異性激活肝癌細(xì)胞中的凋亡信號通路，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡. USP13（Ubiquitin Specific Protease 13）是去泛素化酶家族的一員，能夠去泛素化和穩(wěn)定PTEN分子. 在Huh7和HLCZ01這兩種肝癌細(xì)胞中感染NDV時(shí)，USP13的表達(dá)水平均明顯降低. 在NDV感染的Huh7和HLCZ01細(xì)胞中過表達(dá)USP13，細(xì)胞凋亡均明顯受到抑制. 反之，敲低細(xì)胞中USP13的水平，細(xì)胞凋亡明顯得到增強(qiáng). 進(jìn)一步揭示了USP13抑制NDV誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，在兩種肝癌細(xì)胞中過表達(dá)USP13雖然不影響細(xì)胞中NDV的復(fù)制，但發(fā)現(xiàn)USP13能夠上調(diào)凋亡信號通路中的一個(gè)重要分子Bcl-2，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的凋亡. USP13在NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)為肝癌的溶瘤病毒治療提供了一個(gè)新的理論依據(jù).

關(guān)鍵詞：USP13;NDV;肝癌;凋亡;c-PARP;Bcl-2;細(xì)胞;酶

中圖分類號：Q71? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

USP13 Restrains Apoptosis of Liver Cancer Cells Induced by NDV

ZHU Haizhen1，2，3?，HUANG Xiang1，2，3，WANG Jingjing1，2，3，XU Yan1，2，3，

CHEN Jinwen1，2，3，WANG Xintao1，2，3

（1. College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China;

2. Institute of Pathogen Biology and Immunology，Hunan University，Changsha 410082，China;

3. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract： Newcastle Disease Virus is an avian virus with strong replication ability，which can specifically identify and kill tumor cells. When liver cancer cells are infected with NDV，the apoptosis signaling pathway is activated，inducing apoptosis. USP13 （Ubiquitin Specific Protease 13） is a member of the ubiquitination enzyme family，and deubiquitylate and stabilize PTEN. The expression of USP13 is obviously decreased when NDV infected Huh7 or HLCZ01 cells. USP13 is overexpressed in NDV-infected Huh7 or HLCZ01 cells，which significantly restrains apoptosis. Conversely，knockdown USP13 significantly enhances apoptosis. Further studies revealed the underlying mechanism that USP13 restrains NDV-induced apoptosis. Although overexpression of USP13 doesn't affect NDV replication in two types of liver cancer cells，USP13 can upregulate an important molecule Bcl-2，thereby inhibiting apoptosis. USP13 plays an important role in NDV-induced apoptosis. At the same time，a new theory basis for the oncolytic treatment of liver cancer is provided.

Key words： USP13;NDV;HCC;apoptosis;c-PARP;Bcl-2;cell;enzyme

肝癌是世界上較為常見的惡性腫瘤之一. 該腫瘤具有惡性程度較高，病情發(fā)展快，預(yù)后性較差等特點(diǎn)[1].目前肝癌的傳統(tǒng)治療方法主要以手術(shù)切除為主，結(jié)合放射治療、化學(xué)藥物治療等方法進(jìn)行綜合治療. 總體治療效果不盡如人意. 臨床上使用的化學(xué)治療、放射治療等治療方法，除對患者的腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用外，也會(huì)對正常細(xì)胞帶來較大傷害，所以亟需尋找一種特異性高且副作用低的肝癌治療方法[2].

溶瘤病毒發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)后期，一位女性宮頸癌病人在接種狂犬疫苗后，她體內(nèi)腫瘤的生長竟“神奇地”受到抑制，科學(xué)家意識(shí)到某些溶瘤病毒可以殺傷腫瘤細(xì)胞. 隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，科學(xué)家們可以修飾并且改造溶瘤病毒，使其具有特異性殺傷腫瘤的能力. 目前，溶瘤病毒治療腫瘤已成為較有發(fā)展?jié)摿Φ闹委煼椒ㄖ唬瑸榘┌Y病人帶來巨大的希望[3].

NDV屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬，它被發(fā)現(xiàn)于英國新城，因此命名為新城疫病毒，它的基因組是單股、負(fù)鏈的RNA. NDV能夠感染禽類，在禽類中有很高的致病性，對禽類具有較大的殺傷力. 但是感染人的情況很少，即使感染人也不會(huì)傳染給其他人，只是輕微地出現(xiàn)一些炎癥反應(yīng)等，可通過人體的免疫調(diào)節(jié)功能而自行消失. 經(jīng)過諸多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，NDV能夠特異性殺傷很多類型的腫瘤細(xì)胞，并且對正常細(xì)胞沒有較大影響. 同時(shí)在細(xì)胞感染NDV時(shí)，會(huì)產(chǎn)生許多細(xì)胞因子，如干擾素、腫瘤壞死因子等，這些細(xì)胞因子激活免疫系統(tǒng)中的T淋巴細(xì)胞，最后殺傷腫瘤細(xì)胞[4]. 由于NDV具有這些特性，它成為抗腫瘤溶瘤病毒當(dāng)中研究較多的病毒之一.

據(jù)報(bào)道，NDV感染腫瘤細(xì)胞并殺傷腫瘤細(xì)胞是通過激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡. 細(xì)胞凋亡一般可分為外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑. 外源性凋亡途徑又被稱為死亡受體凋亡途徑，當(dāng)外源性凋亡信號通路被激活時(shí)，死亡配體結(jié)合膜上的死亡受體，死亡受體得到激活，死亡受體與信號通路中的轉(zhuǎn)導(dǎo)分子FADD結(jié)合激活下游的Caspase8，從而級聯(lián)激活下游的凋亡執(zhí)行者Caspase3、Caspase6和Caspase7. Caspase家族中的凋亡執(zhí)行者以聚ADP核糖聚合酶（PARP）為底物，把PARP切割成89 kD和24 kD兩個(gè)分子蛋白，而被切割的PARP（cleaved-PARP）無法對損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，最后導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡. 內(nèi)源性凋亡途徑又被稱為線粒體凋亡途徑，是脊椎動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要途徑之一. 當(dāng)內(nèi)部凋亡刺激因子刺激細(xì)胞，如DNA損傷、細(xì)胞低氧、癌基因活化等，線粒體凋亡信號通路就會(huì)被激活，線粒體膜通透性發(fā)生改變，致使線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素（Cytochrome C）被釋放出來，最后細(xì)胞色素C、凋亡蛋白酶活因子-1和Caspase9形成一個(gè)凋亡小體. 該凋亡小體可以活化下游的Caspase3、Caspase7，最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡[5].

在本文研究中，用NDV分別感染Huh7和HLCZ01兩種肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP13的mRNA水平、蛋白水平都明顯降低. 同時(shí)在兩種肝癌細(xì)胞中過表達(dá)USP13，發(fā)現(xiàn)能夠抑制NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡. 反之，沉默USP13可以增強(qiáng)NDV誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡. 經(jīng)過研究，發(fā)現(xiàn)USP13不影響NDV的復(fù)制，但是能夠上調(diào)凋亡信號通路中的重要分子Bcl-2，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，這也初步揭露了USP13抑制NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制.

1? ?材料與方法

1.1? ?細(xì)胞系

Huh7細(xì)胞購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫 （ATCC）. HLCZ01細(xì)胞是一種新型的肝癌細(xì)胞系[6]，從湖南省腫瘤醫(yī)院臨床病人肝組織中分離并純化培養(yǎng). 293T細(xì)胞購買于博士德生物公司. 所有細(xì)胞均在CO2濃度為5%的37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2? ?實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基底液和DMEM/F-12培養(yǎng)基底液，胎牛血清（FBS），地塞米松，ITS，青霉素和鏈霉素，左旋谷氨酰胺，非必須氨基酸，胰蛋白酶，1×PBS，TRIzol試劑，異丙醇，氯仿，DEPC水，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR定量PCR試劑盒，RIPA 細(xì)胞裂解液，蛋白酶抑制劑，BCA試劑盒，膠回收試劑盒，內(nèi)切酶，T4連接酶，LB培養(yǎng)基，氨芐，質(zhì)粒提取試劑盒，30%聚丙酰胺，10%APS，F(xiàn)lag、USP13、PARP、Bcl-2、β-actin、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗等抗體，1×TBS，吐溫，化學(xué)發(fā)光顯影液，新城疫病毒（NDV）.

六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，微量移液槍槍頭，十二孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1.5 mL離心管，15 mL離心管，10 cm細(xì)胞培養(yǎng)盤，RT-PCR八聯(lián)管，濾紙，PVDF膜.

1.3? ?實(shí)驗(yàn)儀器

-80 ℃超低溫冰箱，-20 ℃冰箱，4 ℃冰箱，4 ℃低溫高速離心機(jī)，冷凍離心機(jī)，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，電動(dòng)移液槍，水浴鍋，超凈工作臺(tái)，超凈生物安全柜，微量移液槍，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，細(xì)菌培養(yǎng)箱，倒置光學(xué)顯微鏡，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，電泳槽，分光光度計(jì)，分析天平，超純水儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，電泳儀，PCR儀，凝膠成像儀器，化學(xué)發(fā)光成像儀器.

1.4? ?實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1? ?構(gòu)建質(zhì)粒

為了構(gòu)建USP13過表達(dá)質(zhì)粒，首先在NCBI上找到相對應(yīng)的編碼區(qū)，再設(shè)計(jì)前后引物. 提取HLCZ01細(xì)胞中的總RNA，并以其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，優(yōu)化PCR條件，擴(kuò)增USP13目的基因. 接著進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)核酸maker判斷其條帶大小是否正確. 然后進(jìn)行膠回收PCR產(chǎn)物，分別雙酶切PCR產(chǎn)物和p3×FLAG-CMV-vector 2 h，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收純化，確定目的基因和載體比例加入T4連接酶，在16 ℃連接12～16 h，用感受態(tài)大腸桿菌（DH5α）進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn). 轉(zhuǎn)化成功后，挑取單克隆菌落在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，最后用質(zhì)粒提取試劑盒提取菌內(nèi)的質(zhì)粒. 提取的質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切鑒定，顯示連接片段大小正確無誤. 把質(zhì)粒送去測序公司測序，測序公司返回測序序列. 經(jīng)過軟件比對，擴(kuò)增的目的基因序列與USP13一致，并且無突變. 把該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞，通過western blot檢測該質(zhì)粒表達(dá)成功.

為了構(gòu)建USP13沉默質(zhì)粒，首先在相關(guān)網(wǎng)站上得到USP13的沉默靶序列，再根據(jù)沉默載體說明書設(shè)計(jì)Top鏈和Bottom鏈，然后把這兩條引物鏈退火結(jié)合后與pRNAT-U6載體連接，得到Sh-USP13沉默質(zhì)粒，最后送去測序公司測序. 測序結(jié)果鑒定插入的序列是正確的. PCR克隆引物和沉默USP13質(zhì)粒靶序列如表1、表2所示.

1.4.2? ?Real-time RCR實(shí)驗(yàn)

首先用PBS把鋪在細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞洗一遍，之后加入TRIzol試劑把細(xì)胞吹打下來，吸到1.5 mL的離心管中，根據(jù)試劑說明書提細(xì)胞總RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒把RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用SYBR RT-PCR試劑盒檢測目的基因的表達(dá)水平. 目的基因的定量序列如表3所示.

1.4.3? ?western blot 實(shí)驗(yàn)

首先用PBS把鋪在細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞洗一遍，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA Buffer裂解液，用刮子把細(xì)胞刮下來，吸到1. 5 mL的離心管中，低溫下裂解15 min，然后以13 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上清. 根據(jù)BCA試劑盒說明書配置BCA試劑，37 ℃水浴加熱0.5 h，借助分光光度計(jì)儀器測量蛋白濃度. 加入等量的蛋白樣品，再加入2×Laemmli Sample Buffer使其體積相同，100 ℃恒溫金屬浴加熱5 min使蛋白變性. 進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白的大小決定電泳時(shí)間，采用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜2 h，當(dāng)?shù)鞍邹D(zhuǎn)至PVDF膜上之后，1×TBST洗一遍，以5%的牛奶封閉0.5 h，1×TBST洗3遍，再加入目的蛋白一抗4 ℃孵育過夜. 第二天用1×TBST洗3遍，再選用一抗所對應(yīng)的二抗室溫下孵育2 h以上，1×TBST洗3遍后，配置化學(xué)發(fā)光顯影液，隨后將膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀器上曝光合適的時(shí)間，得到所需的顯影圖像.

1.4.4? ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得到的定量數(shù)據(jù)都以Excel文檔形式保存，分析對照組和實(shí)驗(yàn)組之間的顯著性差異采用Student t-test方法檢測. *P <0.05，**P <0.01，***P <0.001指示顯著性差異程度，認(rèn)為P小于0.05存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2? ?結(jié)? ?果

2.1? ?NDV感染肝癌細(xì)胞降低USP13的表達(dá)水平

Huh7細(xì)胞是由日本病毒學(xué)家Takaji Wakita從病人血清中分離出來的一種肝癌細(xì)胞系，HLCZ01細(xì)胞是由本實(shí)驗(yàn)室從臨床病人肝組織分離出來的一種肝癌細(xì)胞系，Huh7細(xì)胞相較于HLCZ01細(xì)胞對NDV更為敏感. 本文以切割的PARP作為細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志.

當(dāng)前在很多臨床試驗(yàn)中，采用溶瘤病毒殺傷腫瘤細(xì)胞. NDV是能選擇性在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[7]，同時(shí)不影響正常細(xì)胞的一種溶瘤病毒. NDV感染本實(shí)驗(yàn)的兩種肝癌細(xì)胞，當(dāng)感染一定的時(shí)間，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生皺縮，最后被感染的許多細(xì)胞形成“病灶”，可在倒置顯微鏡觀察到“病灶”（圖1）. 用NDV感染Huh7細(xì)胞24 h，收取細(xì)胞的mRNA，發(fā)現(xiàn)USP13的mRNA呈現(xiàn)下調(diào)趨勢（圖2）. 接著同等實(shí)驗(yàn)條件收取病毒感染細(xì)胞24 h、30 h的蛋白，USP13的蛋白水平也明顯降低（圖3），western blot結(jié)果灰度分析如圖4所示. 為了避免細(xì)胞的特異性，我們又選擇了另外一個(gè)肝癌細(xì)胞系HLCZ01來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，NDV感染HLCZ01細(xì)胞分別收取細(xì)胞的mRNA和蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上文的結(jié)果相一致（圖5、圖6），western blot結(jié)果灰度分析如圖7所示. 本實(shí)驗(yàn)選取另一種病毒VSV作為陰性對照，說明NDV對USP13的調(diào)控是特異性的. 這些結(jié)果表明，NDV感染肝癌細(xì)胞可以降低USP13的表達(dá)水平，暗示USP13可能在NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著某種作用.

2.2? ?過表達(dá)USP13抑制NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡

構(gòu)建了USP13的過表達(dá)質(zhì)粒，探究USP13對于NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡是否有影響. 在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染USP13質(zhì)粒24 h后，再用NDV感染細(xì)胞，通過離心把培養(yǎng)基上清的死細(xì)胞收集起來. Western blot結(jié)果顯示PARP被切割程度明顯減弱，說明USP13抑制了細(xì)胞凋亡（圖8）. 在另外一種肝癌細(xì)胞系HLCZ01重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果是相似的. 表明在HLCZ01細(xì)胞與Huh7細(xì)胞中過表達(dá)USP13都是抑制NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡（圖9），說明USP13在NDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中扮演了重要的角色.

2.3? ?沉默USP13促進(jìn)NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡

過表達(dá)USP13抑制NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡，沉默USP13能否能促進(jìn)NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡. 為了證實(shí)這一猜測，本文構(gòu)建了USP13沉默質(zhì)粒，分別在Huh7、HLCZ01細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Sh-USP13質(zhì)粒24 h，再分別用NDV感染細(xì)胞. 結(jié)果表明，在Huh7、HLCZ01細(xì)胞中敲低USP13的水平，促進(jìn)NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡（圖10，圖11）.

2.4? ?USP13不影響NDV的復(fù)制

為了探究USP13影響NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡是否通過影響NDV的復(fù)制來實(shí)現(xiàn). 在Huh7、HLCZ01細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染USP13質(zhì)粒24 h，再用NDV分別感染細(xì)胞24 h、36 h，提取細(xì)胞的RNA，檢測細(xì)胞內(nèi)NDV的RNA水平. qRT-PCR數(shù)據(jù)說明了細(xì)胞內(nèi)NDV的復(fù)制水平?jīng)]有較大差異（圖12，圖13），說明USP13不影響細(xì)胞內(nèi)NDV的復(fù)制，同時(shí)也從側(cè)面暗示了USP13在凋亡信號通路中發(fā)揮著重要作用.

2.5? ?USP13增強(qiáng)Bcl-2的蛋白水平

通過上述實(shí)驗(yàn)，說明USP13不影響細(xì)胞內(nèi)NDV的復(fù)制，那么它一定靶向于細(xì)胞凋亡信號通路中的某個(gè)分子，從而影響細(xì)胞凋亡. Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，它分為抑凋亡分子和促凋亡分子. 抑凋亡分子包括Bcl-2[8]和Bcl-x，促凋亡分子包括 Bax、Bak、Bad和Bid. 在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染USP13質(zhì)粒24 h，再用NDV感染細(xì)胞，最后收集細(xì)胞的蛋白. 我們采用western blot方法檢測了Bcl-2的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Bcl-2明顯增強(qiáng)（圖14，圖15）. 表明USP13調(diào)控凋亡信號通路中抑凋亡蛋白分子Bcl-2，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的凋亡.

3? ?討? ?論

肝癌嚴(yán)重威脅著人類健康，它的治療方法包括手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)藥物治療等，但是都沒有很好的療效，所以亟待開發(fā)新的抗腫瘤治療方法[9]. 溶瘤病毒能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞并且殺傷腫瘤細(xì)胞. NDV是溶瘤病毒大家庭的一員，NDV除了可以感染腫瘤細(xì)胞直接殺傷腫瘤細(xì)胞外，還可以影響腫瘤細(xì)胞免疫原性或者誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)從而殺傷腫瘤細(xì)胞[10]. NDV可以激活外部凋亡信號通路從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡. NDV可以激活線粒體凋亡信號通路. NDV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是一個(gè)較為復(fù)雜的調(diào)控過程.

本文研究發(fā)現(xiàn)兩種不同的肝癌細(xì)胞感染NDV，細(xì)胞中的USP13水平均呈現(xiàn)降低的趨勢. USP13是一種去泛素化酶，泛素化和去泛素化這兩種蛋白修飾參與了細(xì)胞中很多的生理進(jìn)程[11]. USP13可能調(diào)控NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡. 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)論證，過表達(dá)USP13能夠抑制NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡，反之，敲低細(xì)胞中USP13的水平能夠促進(jìn)NDV誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡. 實(shí)驗(yàn)表明，USP13不影響NDV的復(fù)制，也從側(cè)面說明了USP13是影響細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路. western blot實(shí)驗(yàn)揭示USP13能夠增強(qiáng)Bcl-2家族中的抑凋亡蛋白Bcl-2，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受到抑制. 雖然找到了USP13調(diào)控NDV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的靶分子Bcl-2，但是還有很多問題需要深入探索. USP13是否與Bcl-2相互作用直接調(diào)控Bcl-2，又或者是USP13通過其他分子來間接調(diào)控Bcl-2，它是如何上調(diào)Bcl-2的蛋白水平，是否通過發(fā)揮USP13去泛素化酶的活性抑制Bcl-2的泛素化降解，這些還未解決的問題將會(huì)被繼續(xù)探索，相信這是一個(gè)全新的挑戰(zhàn). 本文的研究為肝癌的溶瘤病毒治療提供了一個(gè)新的理論依據(jù)，為以后研發(fā)新型特異的肝癌治療方法奠定了基礎(chǔ).

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