郭 睿,李宗芳,楊 軍,*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科,西安 710004;2生物與診斷治療國家地方聯(lián)合工程研究中心;*通訊作者,E-mail:yangjundr@163.com)

由CDKN2A基因(p16基因)編碼的P16INK4a(簡(jiǎn)稱P16),又稱CAKN2A(cyclin-dependent kinase inhibitor2A),MTS-1(multiple tumor suppressor1),INK4A(inhibitor of CDK4)等,是細(xì)胞周期G1/S期檢查點(diǎn)(check point)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子和重要的抑癌基因。P16-CDK4/6-cyclin D-pRb通路調(diào)控異常則是引起G1/S轉(zhuǎn)換導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖的重要機(jī)制。既往認(rèn)為,編碼P16INK4a蛋白的CDKN2A基因的純合性缺失(homozygous deletion)、雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)、點(diǎn)突變(point mutation)和啟動(dòng)子超甲基化(promoter hypermethylation)是腫瘤細(xì)胞周期異常的主要機(jī)制[1,2]。高危型HPV(high risk human papillomavirus)E7蛋白與Rb蛋白結(jié)合誘導(dǎo)的P16反式激活(HPV-induced transactiva-tion of P16)雖是細(xì)胞應(yīng)急的無效反應(yīng),但籍此導(dǎo)致的P16代償性高表達(dá)卻成為高危型HPV相關(guān)惡性腫瘤特異性的免疫表型和分子診斷靶標(biāo)[3-6]。而近來發(fā)現(xiàn)在非HPV相關(guān)腫瘤中不僅存在P16表達(dá)的缺失,還存在廣泛的P16代償性彌漫性過表達(dá),且與腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)[7,8]?？梢?P16也可作為非HPV相關(guān)惡性腫瘤診斷的分子靶標(biāo),但其分子機(jī)制和臨床意義卻不盡相同。

因此,正確判讀在非HPV相關(guān)惡性腫瘤中不同表達(dá)模式的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義具有重要的臨床價(jià)值。該文擬主要探討P16蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制及免疫組化染色結(jié)果的判讀方法和臨床意義。

1 P16-CDK4/6-cyclin D-pRb通路與細(xì)胞周期調(diào)控

P16-CDK4/6-cyclin D-pRb通路是調(diào)控G1/S期檢查點(diǎn)的核心。其中,Rb基因突變、缺失及其編碼的Rb蛋白的磷酸化狀態(tài)通過直接調(diào)控pRb/E2F復(fù)合物的動(dòng)態(tài)平衡而決定下游基因的轉(zhuǎn)錄和G1/S期的轉(zhuǎn)換,而位于其上游的P16不僅能直接競(jìng)爭(zhēng)性特異結(jié)合、下調(diào)CDK4/6激酶活性、抑制Rb磷酸化,還能通過破壞CDK4/6和非P16相關(guān)CDK抑制因子的結(jié)合而抑制CDK2的活化而抑制Rb磷酸化。而非磷酸化Rb通過與E2F結(jié)合而抑制其轉(zhuǎn)錄活性,引起G1/S期阻滯。同時(shí),p53、p21等抑癌基因在調(diào)控Rb基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和磷酸化中也發(fā)揮重要作用。而一旦Rb基因缺失、突變或因p16、p53、p21等基因缺失/突變而引起的磷酸化Rb則喪失E2F結(jié)合能力,導(dǎo)致E2F釋放,活化下游基因的轉(zhuǎn)錄和G1/S期轉(zhuǎn)換[9-11]。

可見,P16的表達(dá)狀態(tài)和經(jīng)由P16-CDK4/6-cyclin D-pRb通路對(duì)Rb蛋白表達(dá)和磷酸化水平的調(diào)節(jié)不僅是調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)換的核心分子機(jī)制,也是腫瘤重要免疫表型。

2 p16基因定位及P16功能

由CDKN2A基因編碼的P16蛋白定位于細(xì)胞核,半衰期僅0.5-3.5 h,可經(jīng)蛋白酶體依賴方式降解[6]。P16是細(xì)胞周期調(diào)控中關(guān)鍵性負(fù)性調(diào)控因子,不僅能通過抑制Rb磷酸化引起G1/S期阻滯,也可通過抑制CDK7對(duì)RNA聚合酶Ⅱ羧基端磷酸化和JNK1/3激酶活性等途徑引起細(xì)胞周期阻滯,還能通過負(fù)性調(diào)節(jié)紫外線(ultraviolet,UV)誘導(dǎo)的c-Jun磷酸化、干擾H-Ras-JNK-c-Jun-AP1信號(hào)軸引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外,由癌基因、基因毒性藥物誘導(dǎo)的DNA損傷等因素引起的P16過表達(dá)不僅能加速正常細(xì)胞衰老,也能誘導(dǎo)祖細(xì)胞、癌前細(xì)胞、造血干細(xì)胞的衰老和腫瘤細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡[12]。

3 p16基因表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制

編碼P16的CDKN2A基因定位于9p21的INK4b/ARF/INK4a基因座,該基因座內(nèi)基因的遺傳與表遺傳學(xué)(genetic or epigenetic)調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜,各基因既可共享協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)制,也均可通過不同信號(hào)通路獨(dú)立調(diào)控而發(fā)揮相應(yīng)功能。

3.1 INK4b/ARF/INK4a基因座內(nèi)基因的協(xié)同調(diào)節(jié)

染色質(zhì)重塑是引起INK4b/ARF/INK4a基因座內(nèi)基因群共生并呈特征性同步表達(dá)的重要原因,且易受單基因或多重基因事件影響。其中,純合性缺失是導(dǎo)致該基因座內(nèi)p16、p15、p14ARF基因在多種腫瘤中同步表達(dá)缺失的主要原因[13]。同時(shí),該基因座內(nèi)任一單基因的點(diǎn)突變或內(nèi)含子改變也會(huì)不同程度地分別或同步調(diào)控該基因座內(nèi)其他基因(如p16、p15、p14ARF等)的表達(dá)或活化。而且,兩個(gè)以上基因的共失活(coactivation)或同步缺失較單基因改變更易導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。如p15基因復(fù)制起始點(diǎn)RD的改變和CDC6高表達(dá)及RD/CDC6相互作用的不穩(wěn)定對(duì)該基因座內(nèi)其他基因的表達(dá)均具有全方位影響,且比p16或p14ARF單基因失活引起的細(xì)胞增殖、加速腫瘤進(jìn)展的效應(yīng)更強(qiáng)。此外,PcG(polycomb group of silencers)、Bmi1、Cbx7、Ring1或Phc2均可同步下調(diào)p16、p15、p14ARF表達(dá),PcG相關(guān)蛋白缺失可引起P16、P15、P14ARF的堆積。而SWI/SNF可通過拮抗PcG而維持上述基因持續(xù)表達(dá)。同時(shí),SWI/SNF(hSNF5)還能通過負(fù)反饋回路(feedback loop)上調(diào)P16表達(dá)并引起G1/S阻滯,P16則可負(fù)性調(diào)節(jié)BRG1引起染色體重塑[14]。

3.2 p16基因的遺傳學(xué)改變

純合性/雜合性缺失、點(diǎn)突變和啟動(dòng)子超甲基化是導(dǎo)致p16基因失活或表達(dá)下調(diào)的主要機(jī)制。其中,雜合性缺失和啟動(dòng)子超甲基化介導(dǎo)的基因沉默(methylation-mediated silencing)最為常見[15]。

由于p16基因只含有4個(gè)AR重復(fù)基序(ankyrin repeat),因而其蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較弱,易發(fā)生折疊錯(cuò)誤和突變?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)p16基因中有76個(gè)散在分布的腫瘤相關(guān)錯(cuò)義突變(cancer-related missense mutations),是僅次于p53基因的頻繁突變基因。但大多錯(cuò)義突變、讀碼框內(nèi)小的缺失(in-frame small deletions)只是部分改變或降低了P16蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象穩(wěn)定性,對(duì)其功能影響甚微。同時(shí),由于功能冗余使得P15或P18(或IκBα)蛋白能夠替代或補(bǔ)償錯(cuò)義突變引起的P16蛋白功能的部分缺失。另外,即使P16結(jié)構(gòu)完整,CDC6、cyclin D1、gankyrin和SEI-1過表達(dá)等分子事件也可導(dǎo)致P16潛在性功能失活。因此,在不同類型腫瘤中p16基因的遺傳學(xué)改變和由之決定的P16蛋白的表達(dá)模式、分子機(jī)制及其功能狀態(tài)并不完全一致?？梢?從基因?qū)用娼庾xP16的功能并不可行,即使評(píng)估其在腫瘤發(fā)生中貢獻(xiàn)也應(yīng)謹(jǐn)慎[16,17]。而從蛋白層面通過對(duì)P16蛋白的表達(dá)模式的分析解讀其遺傳學(xué)異常狀態(tài)、功能及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義更具可行性。

3.3 p16基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)

p16基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與其啟動(dòng)子區(qū)的HMG盒相關(guān)蛋白1(HMG box-containing protein 1,HBP1),Ets、Ap1、Sp1結(jié)合位點(diǎn)、INK4a轉(zhuǎn)錄沉默元件(INK4a transcription silence element,ITSE)、過氧化物酶體增生效應(yīng)元件(peroxisome proliferator response element,PPRE)等多重調(diào)控因子有關(guān)[18],機(jī)制甚是復(fù)雜。

高表達(dá)的Ras可經(jīng)Ras-Raf-Mek/Erk-Ets通路上調(diào)Ets1/2的表達(dá)并與p16啟動(dòng)子區(qū)Ets結(jié)合上調(diào)p16表達(dá),MAPK通過磷酸化方式活化Ets1/2,而位于該通路下游的HBP1與p16啟動(dòng)子區(qū)的HBP1結(jié)合也參與了Ras引起的p16表達(dá)上調(diào)。ROS也可反式激活p16表達(dá)并抑制CtBP介導(dǎo)的p16抑制,而Id1不僅可與Ets2結(jié)合抑制上述反式活化途徑,還能抑制E47介導(dǎo)的p16啟動(dòng)子活化。EB病毒的LMP1膜蛋白也能抑制Ets2介導(dǎo)的P16反式激活。高表達(dá)的BMYB(Myb-related protein B)可與p16啟動(dòng)子區(qū)ITSE位點(diǎn)結(jié)合下調(diào)多潛能干細(xì)胞中P16的表達(dá),而刪除ITSE可顯著上調(diào)p16啟動(dòng)子活性,并通過Ras-Raf-Mek信號(hào)通路或其他機(jī)制引起p16基因的反式激活[19]。

Myc與p16啟動(dòng)子區(qū)E-boxes結(jié)合在上調(diào)p16轉(zhuǎn)錄的同時(shí)活化潛在負(fù)性抑制因子Bmi1而增強(qiáng)Myc對(duì)p16表達(dá)調(diào)控的穩(wěn)定性。

Sp(包括Sp1、Sp3、Sp4)與p16啟動(dòng)子區(qū)的GC盒結(jié)合誘導(dǎo)p16轉(zhuǎn)錄,PPARα與p16啟動(dòng)子區(qū)PPRE結(jié)合并與Sp1相互作用而上調(diào)p16表達(dá),PPARγ與PPRE結(jié)合也能活化p16啟動(dòng)子,而磷酸化的PPARγ則可抑制其功能;P300/CBP不僅能通過誘導(dǎo)組蛋白H4乙?；龠M(jìn)p16轉(zhuǎn)錄活化,還能通過Sp1-依賴性的招募和協(xié)同機(jī)制引起p16啟動(dòng)子活化、基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

高表達(dá)的JunB不僅可直接與p16啟動(dòng)子區(qū)Ap1結(jié)合上調(diào)P16表達(dá),還能招募BAF60a到p16啟動(dòng)子區(qū)而活化p16轉(zhuǎn)錄。JunB的拮抗分子c-Jun則可通過負(fù)反饋回路上調(diào)cyclin D1、下調(diào)P16促進(jìn)細(xì)胞增殖,而P16與JNKs結(jié)合則可抑制c-Jun磷酸化和AP-1活性。

此外,Cyclin D1、CDC6、SEI-1/SERTAD1、NF-κB和26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基Gankyrin/PSMD10的活化及HTLV-1基因編碼的Tax等分子也均參與了p16基因表達(dá)和功能調(diào)控。如Gankyrin既通過ARF-MDM2-p53通路參與P53泛素化和蛋白酶體降解,也通過INK4-CDK4-pRb通路與P16競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4促進(jìn)pRb磷酸化降解,還可通過抑制RhoK/ROCK/PTEN通路而在Ras介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用。SEI-1基因編碼的P34SEI-1的過表達(dá)和p16失活在CDK4-pRb-E2F通路中具有協(xié)同作用,不僅參與RB磷酸化、抵抗P16的功能,還通過SEI-1/SET/NM23H1通路顯著提升染色體重塑和微核形成頻率、降低染色體穩(wěn)定性。Tax不僅通過誘導(dǎo)Cyclin D3磷酸化而上調(diào)CDK4激酶活性,還能直接與CDK4結(jié)合降低P16對(duì)CDK4/6的抑制活性,提高Rb的磷酸化水平,促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換。

3.4 P16蛋白表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制

p16基因啟動(dòng)子超甲基化是導(dǎo)致p16基因失活的常見模式之一和最主要的表遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制[17,20]。同時(shí),過表達(dá)的淋巴特異性解旋酶(lymphoid specific helicase,Lsh)通過與p16啟動(dòng)子結(jié)合并招募HDAC1、HDAC2和共抑制復(fù)合物引起Lsh相關(guān)的p16啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3去乙酰化而抑制p16的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。異源性hnRNP A1/2及miR-24-2可負(fù)性調(diào)節(jié)p16 mRNA的轉(zhuǎn)錄及穩(wěn)定性。HuR通過招募RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)參與AUF1介導(dǎo)的p16 mRNA降解。siRNA可通過降低AUF1表達(dá)而上調(diào)p16 mRNA的穩(wěn)定性和P16蛋白表達(dá)。此外,能引起P16蛋白特異位點(diǎn)磷酸化的調(diào)控因子也均可直接或間接調(diào)控P16蛋白的表達(dá)和功能,如P16蛋白的Ser7,Ser8,Ser140,Ser152位點(diǎn)的磷酸化可增強(qiáng)P16與CDK4/6的親和力而引起G1/S期阻滯。

總之,p16基因表達(dá)的調(diào)控既受遺傳和表觀遺傳學(xué)的影響,也受p16基因所在基因座的協(xié)同調(diào)控,還受其相關(guān)信號(hào)通路上、下游相關(guān)調(diào)節(jié)因子的反式激活或負(fù)反饋性調(diào)節(jié)。盡管,p16基因的純合性/雜合性缺失是p16基因失活的最重要分子機(jī)制。但是,P16代償性高表達(dá)卻是惡性腫瘤最常見的免疫表型?？梢?從遺傳和表遺傳學(xué)水平的檢測(cè)并不能有效評(píng)估P16的功能狀態(tài)。

但是,上述復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致的最終結(jié)果卻不外乎P16蛋白的缺失、代償性高表達(dá)與堆積、細(xì)胞內(nèi)的異常定位(由正常核定位變?yōu)橘|(zhì)/核共定位)等幾種模式。而且,P16代償性過表達(dá)可作為高危型HPV相關(guān)或非HPV相關(guān)惡性腫瘤的顯著的免疫表型特征和分子診斷標(biāo)志。因此,采用原位組織學(xué)方法檢測(cè)P16蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)模式無疑將會(huì)為準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞周期G1/S期檢查點(diǎn)異常的分子機(jī)制提供最佳的切入點(diǎn)。但是,P16蛋白在非HPV相關(guān)腫瘤中不同表達(dá)模式的分子機(jī)制和臨床意義卻因腫瘤類型、病因而不盡相同[21]。因此,正確判讀P16蛋白在非HPV相關(guān)惡性腫瘤中不同表達(dá)模式的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義具有重要的臨床價(jià)值。

4 P16蛋白免疫組化染色結(jié)果的判讀

免疫組織化學(xué)染色具有其他技術(shù)無法替代的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),能同時(shí)檢測(cè)靶分子的表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位,是檢測(cè)P16蛋白表達(dá)的首選方法。

如前所述,P16蛋白不同表達(dá)模式反映的是其上下游復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的最終結(jié)果。因此,對(duì)P16蛋白的IHC染色結(jié)果的判讀并不能簡(jiǎn)單地為陽性或陰性方式予以表述,而應(yīng)詳細(xì)描述其表達(dá)模式(亞細(xì)胞定位和表達(dá)水平),以期準(zhǔn)確反映其分子機(jī)制。正常情況下,P16蛋白定位于細(xì)胞核,因其半衰期極短,采用免疫組化并不能被檢出。但是,在腫瘤細(xì)胞中,除p16基因缺失和啟動(dòng)子甲基化引起基因沉默等因素導(dǎo)致P16蛋白表達(dá)缺失外,基因突變和反式激活引起的P16蛋白的降解異常或代償性過表達(dá)常導(dǎo)致P16蛋白在細(xì)胞質(zhì)/核內(nèi)堆積而呈彌漫性強(qiáng)陽性表達(dá)。

因此,在對(duì)P16蛋白免疫組化染色結(jié)果判讀時(shí),建議按照質(zhì)/核型分子的判讀標(biāo)準(zhǔn)[22]進(jìn)行,并以“0-3+”的形式進(jìn)行表述,以確切反映P16蛋白的具體表達(dá)模式及其分子機(jī)制:在顯微鏡低倍鏡下(4×或10×)瀏覽整張切片,以細(xì)胞質(zhì)/核內(nèi)中等強(qiáng)度棕黃色顆粒(DAB染色)作為陽性細(xì)胞判讀界值,染色強(qiáng)度呈中等以上的細(xì)胞判讀為P16表達(dá)陽性細(xì)胞。然后選擇熱點(diǎn)區(qū)域,估算P16陽性細(xì)胞占同類型細(xì)胞的百分比(或面積):①0(陰性):目的細(xì)胞無著色;②1+(弱陽性):≤10%的細(xì)胞質(zhì)/核呈現(xiàn)不同程度棕黃色顆粒;③2+(陽性):10%-30%的細(xì)胞胞質(zhì)/核呈中等強(qiáng)度著色,或≤70%的細(xì)胞胞質(zhì)/核呈現(xiàn)弱或中等強(qiáng)度著色;④3+(強(qiáng)陽性):>30%的細(xì)胞胞質(zhì)/核呈強(qiáng)陽性著色,或>70%的細(xì)胞胞質(zhì)/核呈中等強(qiáng)度陽性著色。

5 P16蛋白表達(dá)的臨床意義

如前所述,腫瘤細(xì)胞中P16蛋白的不同表達(dá)模式(缺失、下調(diào)或上調(diào))不僅與p16基因的遺傳學(xué)、表遺傳學(xué)的改變有關(guān),也與其上下游多種癌基因、抑癌基因的活性和相關(guān)信號(hào)通路上下游調(diào)控因子的狀態(tài)有關(guān),是所有參與P16-CDK4/6-cyclin D-pRb通路和細(xì)胞周期調(diào)控的正、負(fù)調(diào)控因子協(xié)同作用的最終結(jié)果,反映的是腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控異常的不同分子機(jī)制。

5.1 P16蛋白呈陰性表達(dá)

P16在腫瘤細(xì)胞中呈陰性表達(dá),說明:①p16基因的純合性/雜合性缺失、突變、啟動(dòng)子甲基化等可能是該腫瘤細(xì)胞周期異常的主要機(jī)制;②腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控異?？赡茉醋云渌?xì)胞周期檢查點(diǎn)的異常,而與G1/S檢查點(diǎn)無關(guān)。但其他周期檢查點(diǎn)異常是否也能引起P16表達(dá)的繼發(fā)性改變尚未可知。

盡管,p16基因缺失是惡性腫瘤細(xì)胞周期異常的重要機(jī)制之一。在20%的乳腺癌、65%的非小細(xì)胞肺癌、30%的結(jié)直腸癌、60%的膀胱癌、50%-70%的頭頸部鱗癌、60%的黑色素瘤、60%的白血病、70%的食道癌、60%的多發(fā)性骨髓瘤及85%以上的胰腺癌中均存在P16的缺失[23]。但是,由于P16蛋白半衰期短,因而,在正常細(xì)胞中P16蛋白也呈陰性表達(dá)。因而,當(dāng)P16陰性表達(dá)時(shí),實(shí)際上很難判斷是否存在p16基因缺失、突變、啟動(dòng)子甲基化。所以,P16陰性表達(dá)的臨床價(jià)值并不大。

5.2 P16蛋白呈弱陽性表達(dá)

P16在腫瘤細(xì)胞中呈散在性弱陽性表達(dá),說明:①p16基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚存,目的細(xì)胞處于細(xì)胞周期的不同時(shí)相;②可能存在p16基因點(diǎn)突變和啟動(dòng)子的不全甲基化;③細(xì)胞周期調(diào)控異?？赡茉醋云渌?xì)胞周期檢查點(diǎn)的異常；④P16散在性陽性表達(dá)也常是細(xì)胞衰老的特征。

5.3 P16蛋白呈中等強(qiáng)度陽性表達(dá)

P16在腫瘤細(xì)胞中呈中等強(qiáng)度陽性表達(dá),且P16陽性細(xì)胞呈團(tuán)片狀分布,說明:①不存在p16基因的純合性缺失,且p16基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚存;②可能存在p16基因點(diǎn)突變和啟動(dòng)子的不全甲基化;③腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性,部分腫瘤細(xì)胞中p16基因的突變、或G1/S檢查點(diǎn)其他細(xì)胞周期調(diào)控因子異?？赡芡ㄟ^相應(yīng)的反饋機(jī)制引起P16蛋白部分修復(fù)性高表達(dá)或堆積以補(bǔ)償P16蛋白功能的不足;④p16及p14ARF的過表達(dá)是腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)自我更新的關(guān)鍵性必要條件;⑤P16散在性陽性表達(dá)也是應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老或老化的特點(diǎn)。

5.4 P16蛋白呈強(qiáng)陽性彌漫性表達(dá)

P16在腫瘤細(xì)胞中呈彌漫性強(qiáng)陽性表達(dá),說明:①細(xì)胞周期G1/S期檢查點(diǎn)調(diào)控異常是腫瘤細(xì)胞周期異常的主要分子機(jī)制;②不存在p16基因座或p16基因的純合性缺失,且p16基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚存;③P16蛋白失活性突變可引起P16蛋白代償性高表達(dá)的分子機(jī)制;④G1/S期檢查點(diǎn)其他細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子異常(如Rb基因缺失)可能是引起P16蛋白代償性高表達(dá)或堆積的分子機(jī)制。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),高危型HPV感染、Cyclin D1過表達(dá)和pRb突變失活[10-13]等因素引起的P16代償性過表達(dá)不僅是惡性腫瘤顯著的免疫表型特征,也與神經(jīng)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌及口腔癌等腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[17,24,25]。

由于陽性結(jié)果更易于判讀,因而P16彌漫性強(qiáng)陽性表達(dá)的臨床預(yù)測(cè)價(jià)值更高。因而,建議聯(lián)合檢測(cè)P16和Ki67,以利于對(duì)P16呈陰性、弱陽性表達(dá)時(shí)的臨床意義和分子機(jī)制的解讀(見圖1)。

圖1 P16免疫組化染色結(jié)果的判讀

總之,由p16基因缺失、突變、啟動(dòng)子甲基化以及上、下游基因和其他因子經(jīng)異常或經(jīng)由P16-CDK4/6-cyclin D-pRb通路引起的P16蛋白缺失或反式活化而代償性過表達(dá),或降解異常引起的細(xì)胞內(nèi)堆積均是腫瘤細(xì)胞不同細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制異常導(dǎo)致的最終結(jié)果。P16蛋白表達(dá)的不同模式反映的是腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控異常的不同分子機(jī)制。P16蛋白缺失(0)或彌漫性強(qiáng)陽性(3+)表達(dá)均是惡性腫瘤可靠的免疫表型特征,而P16弱陽性或中等強(qiáng)度陽性(1+/2+)既可能是腫瘤細(xì)胞周期異常的結(jié)果,也可能與細(xì)胞衰老或其他因素有關(guān)。