孔雪燕,周東瑞,孟新玲,李艷霞,楊新玲*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,烏魯木齊 830000;2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腦病一科;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常見的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病,按年齡可分為早發(fā)性帕金森病(early onset Parkinson’s disease,EOPD)(發(fā)病年齡≤50歲)和晚發(fā)性帕金森病(late onset Parkinson’s disease,LOPD)(發(fā)病年齡>50歲)。PD的主要病理改變是中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡、紋狀體多巴胺含量顯著減少以及黑質(zhì)區(qū)殘存神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體(即路易小體)。其病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明,涉及年齡、遺傳、環(huán)境等多個方面,關(guān)于遺傳因素的探索主要來源于對表現(xiàn)出孟德爾遺傳性疾病家庭的研究。研究發(fā)現(xiàn)Parkin,Pink1,DJ-1,ATP13A2,PLA2G6和FBXO7基因的常染色體隱性突變與PD易感性相關(guān)聯(lián)[1-6]。其中ATP13A2基因被認(rèn)為與EOPD相關(guān)。經(jīng)過國內(nèi)國外的多年研究積累,目前已發(fā)現(xiàn)ATP13A2基因的多個位點(diǎn)突變與帕金森病相關(guān)[7-10],其中對Ala746Thr突變位點(diǎn)研究較多,在新疆地區(qū)對于ATP13A2基因的研究較少,筆者欲在新疆地區(qū)研究ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)與帕金森病發(fā)病的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 一般資料 病例組為就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、第二附屬醫(yī)院及附屬中醫(yī)醫(yī)院門診及病房的帕金森病患者224例,其中男性116例,女性108例,發(fā)病年齡為41-80歲,平均發(fā)病年齡為(63.40±10.30)歲,維吾爾族44例,漢族180例。對照組為同期與病例組性別、年齡、民族相匹配的,與病例組就診于相同醫(yī)院的健康體檢者及志愿者人群220例,其中男女各110例,發(fā)病年齡為40-80歲,平均發(fā)病年齡(61.67±9.72)歲,維族53例,漢族167例。兩組在性別、年齡、民族之間的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

1.1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入的PD患者均為散發(fā);其診斷符合英國Brain Bank標(biāo)準(zhǔn)[11],排除因中毒、服用抗精神病藥物等繼發(fā)性PD、帕金森疊加綜合征和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病,甲亢及嚴(yán)重的器質(zhì)性疾病。納入病例組的患者均由兩個副主任醫(yī)師級別以上的醫(yī)師嚴(yán)格按照以上診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷。病例組與對照組個體之間無血緣關(guān)系,均為本地居民(至少2代親系在新疆生活)。所有受試對象入組前均得到本人同意,并簽署知情同意書。

表1 病例組與對照組一般情況的比較Table 1 Comparison of the general situation between case group and control group

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取 得到受試對象同意后抽取其肘靜脈血2 ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,使用天根生化(北京)有限公司基因組非離心柱型DNA提取試劑盒提取DNA,并嚴(yán)格按照說明書操作,-20 ℃保存。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 引物序列的設(shè)計(jì)是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲得ATP13A2基因序列找到位點(diǎn)所在位置,由上海生工公司合成。Ala746Thr位點(diǎn)其上游引物為F3 5′-CCACCCACTCTGAGGACTA-3′,下游引物為R3 5′-CAAGGGCCCA-AAAAGATG-CC-3′,PCR 產(chǎn)物長度365 bp。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) PCR反應(yīng)體系:模板DNA 10-20 ng,10*PCR Buffer(Mg2+plus)3 μl,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3 μl,上、下游引物(5 μmol/L)各1.5 μl,TaKaRaTaq酶(5 U/μl)0.3 μl,加水至30 μl。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,69 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s。共35個循環(huán)。4 ℃保存。用美國ABI生產(chǎn)的Veriti 96well PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠,核酸染料染色,凝膠成像儀(英國Syngene)確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量。

1.2.4 直接測序 使用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒進(jìn)行純化后應(yīng)用美國ABI 3730Xl測序儀用雙脫氧鏈末端終止法(Sanger法)進(jìn)行ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)測序,判定樣本的基因型,測序結(jié)果使用DNA STAR軟件進(jìn)行分析,GG型為純合子(野生型),GA型為雜合突變(突變型),AA型為純合突變(突變型)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物片段為365 bp,2%瓊脂糖凝膠電泳上可顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖1)。

M. DNA Marker帶;1-9. Ala746Thr位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 SNP分型結(jié)果

224例PD患者樣本的ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)檢測發(fā)現(xiàn)1例GA型(突變型),突變病例為EOPD漢族女性患者,其余均為GG型(野生型),未發(fā)現(xiàn)AA基因型突變(見圖2)。220例對照組樣本,Ala746Thr位點(diǎn)檢測均為GG型,未發(fā)現(xiàn)GA型及AA型突變。

A. GG型(野生型) B. GA型(突變型)箭頭所指為堿基替換處,從左向右第13個堿基序列由G突變成了A

2.3 病例組與對照組Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率的比較

兩組Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

2.4 按性別分層Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率的比較

男性病例組與對照組Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);女性病例組與對照組Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

2.5 維吾爾族與漢族Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率的比較

維吾爾族病例組與對照組Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);漢族病例組與對照組Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

2.6 按年齡分層Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率的比較

≤50歲病例組與對照組Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);>50歲病例組與對照組Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

2.7 病例組Ala746Thr位點(diǎn)不同性別、年齡之間基因型及等位基因頻率的比較

病例組男性與女性Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);病例組≤50歲與>50歲的Ala746Thr位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表3)。

3 討論

人類ATP13A2基因位于1p36 PARK9位點(diǎn)內(nèi),全長26 kb,共29個外顯子,開放編碼區(qū)含3 543個核苷酸,共編碼1 180個氨基酸[4],最初被鑒定為Kufor-Rakeb綜合征(KRS)的致病基因,KRS是罕見的青少年型帕金森病的遺傳形式,除了有帕金森病癥狀外,還存在有痙攣、癡呆、核上性注視麻痹,1994年由Najim等[12]在約旦的Kufor-Rakeb社區(qū)5名未受影響的血緣親屬中首次提出,2006年Ramirez等[4]在一個同源的智利家庭中鑒定出復(fù)合雜合子ATP13A2突變,并且這個基因突變也在約旦家族中被證實(shí)。此后在早發(fā)性、家族性或散發(fā)性PD患者中發(fā)現(xiàn)了一些純合子(Phe182Leu[7],Gly504Arg[8]和Gly877Arg[9])和雜合子(Thr12Met[8],Gly533Arg[8],Ala746Thr[10])錯義突變,純合子突變通常導(dǎo)致青少年出現(xiàn)帕金森綜合征(10-22歲),而雜合突變與早發(fā)性帕金森綜合征有關(guān)。

Lin等[10]在182例PD患者(71例來自臺灣,111例來自新加坡)和589例未患有PD的對照者(220例來自臺灣,369例來自新加坡)中發(fā)現(xiàn)3例PD患者有ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變,包括2例散發(fā)的EOPD(1例來自臺灣,1例來自新加坡)和1例家族性LOPD(來自臺灣),由此得出亞洲罕見的ATP13A2變異與帕金森病患病風(fēng)險增加有關(guān)。需要進(jìn)一步的研究來闡明這種遺傳風(fēng)險因子的功能作用。Chen等[14]研究臺灣493例PD患者和種族匹配的585例對照者時發(fā)現(xiàn)2例PD患者及4例正常對照存在ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變,且在1例對照者的99mTc-TRODAT-1 SPECT研究中顯示在右側(cè)紋狀體中99mTc-TRODAT-1攝取不對稱減少,與PD的征象相似,此對照者有嗅覺下降,這提示黑質(zhì)紋狀體多巴胺能途徑有缺陷。Fei等[15]對中國大陸532例PD患者和480例健康對照研究中發(fā)現(xiàn)2例ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變,其中1例為EOPD,1例為健康對照者(年齡>50歲),并得出ATP13A2基因Ala746Thr變異與中國大陸漢族人群帕金森病缺乏關(guān)聯(lián)。Chan等[16]在中國大陸262例PD患者和182例健康對照組中發(fā)現(xiàn)3例突變,其中2例為PD患者(1例為EOPD,1例為LOPD),1例健康對照者,沒有發(fā)現(xiàn)ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變與EOPD或LOPD之間的關(guān)聯(lián)。Pan等[17]用Meta分析的方法探討漢族人群ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變與帕金森病的相關(guān)性得出該位點(diǎn)突變與漢族人群帕金森病患者的發(fā)病風(fēng)險無關(guān)。

表2 Ala746Thr位點(diǎn)總體及按性別、年齡、民族進(jìn)行分層后基因型及等位基因頻率的比較 例(%)Table 2 Comparison of genotype and allele frequencies in overall and after stratified by sex, age and ethnic in Ala746Thr site cases(%)

表3 病例組Ala746Thr位點(diǎn)不同性別、年齡之間基因型及等位基因頻率的比較 例(%)Table 3 Comparison of genotype and allele frequencies among different genders and ages in case group at the Ala746Thr site cases(%)

由以上可知ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變頻率很低,其與PD發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變在新疆地區(qū)研究較少,王芳等[18]對新疆地區(qū)429例PD患者和390例正常對照者研究未發(fā)現(xiàn)ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變,李沛珊等[19]通過研究新疆地區(qū)4個無血緣關(guān)系家系共16例家族性PD患者、220例散發(fā)性PD以及240例健康對照組也沒有發(fā)現(xiàn)Ala746Thr位點(diǎn)突變,為進(jìn)一步探討ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變與PD發(fā)病的關(guān)系,本研究擴(kuò)大了研究范圍,涉及新疆烏魯木齊多個三甲醫(yī)院,對受試對象進(jìn)行更加細(xì)致的問卷調(diào)查(包括睡眠、嗅覺、認(rèn)知功能等多個方面),共納入224例病例組與220例對照組,受試對象均來自新疆南北疆本土的維吾爾族和漢族居民,發(fā)現(xiàn)1例ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)GA基因型雜合突變,未發(fā)現(xiàn)AA基因型突變,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析病例組與對照組基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,通過性別、年齡、民族分層比較差異仍沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與既往研究結(jié)果基本一致。突變樣本W(wǎng)p377為PD患者,女性,漢族,發(fā)病年齡為44歲,病程1年,此患者首發(fā)癥狀為運(yùn)動遲緩,左下肢肌張力增高,左膝關(guān)節(jié)疼痛,未見明顯靜止性震顫,美多芭初始治療有效,PETCT提示右側(cè)頂葉腦FDG代謝減低,右側(cè)殼核體尾部及左側(cè)殼核尾部CFT呈低代謝,考慮帕金森病改變。因突變率太低,無法與其他GG型PD患者進(jìn)行臨床比較。

本研究在224例PD患者中僅1例ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變,提示新疆地區(qū)ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變是鮮有的,ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變可能不是新疆地區(qū)PD患者發(fā)病易感因素。結(jié)合世界各地的各項(xiàng)研究也提示ATP13A2基因Ala746Thr位點(diǎn)突變在PD患者中仍存在,我們的研究同樣擴(kuò)大了ATP13A2基因突變的癥狀譜,為進(jìn)一步研究ATP13A2基因?qū)D的發(fā)病機(jī)制研究提供了一定的臨床資料。鑒于本研究樣本例數(shù)較少,且收集病例均來自新疆大型三甲醫(yī)院,樣本可能存在信息偏倚,日后需繼續(xù)擴(kuò)大樣本數(shù)量以及收集范圍進(jìn)行研究。