海 玲,杜 華,趙 靜,師永紅

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,呼和浩特 010110;*通訊作者,E-mail:13514815271@163.com)

“三陰”乳腺癌是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體-2(HER-2)均陰性的乳腺癌,其復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差[1]。惡性腫瘤發(fā)生時,由于腫瘤細(xì)胞增殖失控,必然會出現(xiàn)低氧或缺氧的微環(huán)境,繼而使缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)、表達(dá)增加。HIF-1在乳腺癌的浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[2,3]。細(xì)胞角蛋白18(CK18)是一個重要的中間絲蛋白,是哺乳類動物細(xì)胞骨架的組成成分,它主要表達(dá)于上皮組織中,在上皮性腫瘤的分化和侵襲過程中可出現(xiàn)表達(dá)異?，F(xiàn)象,并且與預(yù)后有關(guān)。但CK18的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系尚有爭議[4,5]。

目前,對“三陰”乳腺癌尚缺乏靶向治療的措施。本課題組的前期研究顯示人“三陰”乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α呈高表達(dá)、并表現(xiàn)出高侵襲力和生長迅速的特點,干擾HIF-1α后,細(xì)胞表現(xiàn)出生長緩慢、成瘤能力減弱、侵襲能力下降和細(xì)胞凋亡增加的生物學(xué)行為變化。雙向凝膠電泳聯(lián)合飛行質(zhì)譜分析提示CK18是HIF-1α的靶蛋白之一,干擾MDA-MB-231細(xì)胞的HIF-1α,同時顯示出CK18表達(dá)下降[6]。為進(jìn)一步研究CK18對“三陰”乳腺癌的作用,本實驗構(gòu)建了CK18真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染到了HIF-1α干擾后的“三陰”乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst凋亡檢測試劑盒檢測CK18對細(xì)胞周期及凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系提供。DH5α感受態(tài)細(xì)胞為內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)實驗室保存。shRNA干擾試劑盒、兔抗人HIF-1α多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ公司。兔抗人CK18抗體購自英國Abcam公司。高效克隆PCR產(chǎn)物(TA Cloning)的專用載體PMD?18-T Vector、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶購自大連生物工程公司;增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體PEGFP-C1購自美國Clontech公司。DMEM購自美國GIBICO公司,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自美國Hyclone公司。RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶、鼠抗人β-tubulin單克隆抗體、Hoechst凋亡染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。引物合成及質(zhì)粒提取試劑盒均購自上海生物工程有限公司。DNA凝膠回收試劑盒購自美國Axygen公司,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 構(gòu)建CK18-PEGFP-C1真核表達(dá)載體

通過NCBI網(wǎng)站,在GenBank中查找人CK18的全基因序列(登錄號:NM-000224.2)。采用Premier Primer 5軟件設(shè)計了人CK18基因的特異引物:上游:5′-CTCGAGAAAGCCTGAGTCCTGTC-3′,下游:5′-GAATTCTTATTGGCCTCCTGCTCC-3′,擴(kuò)增片段長度約為1 375 bp。提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行RT-PCR,回收目的基因片段與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白為報告基因的空載體PEGFP-C1連接。將連接產(chǎn)物CK18-PEGFP-C1送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 CK18真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染封閉HIF-1α基因的MDA-MB-231細(xì)胞

本研究選擇了美國SANTA CRUZ公司的shRNA Plasmid Transfection Reagent試劑進(jìn)行了HIF-1α shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(試劑盒中的對照shRNA作為陰性對照轉(zhuǎn)染),用含有嘌呤酶素的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測HIF-1α的mRNA及蛋白在干擾后的MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)。利用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將真核表達(dá)載體CK18-PEGFP-C1與陰性對照空載體PEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染入HIF-1α shRNA干擾的MDA-MB-231細(xì)胞中。培養(yǎng)24 h時,熒光顯微鏡下評估轉(zhuǎn)染效率,Western blot檢測CK18蛋白的表達(dá)情況。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡

將轉(zhuǎn)染CK18和空載體的兩組細(xì)胞培養(yǎng)至80%滿時,分別用胰酶消化進(jìn)行前處理,加入PI使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期;加入Annexin Ⅴ/PI檢測細(xì)胞凋亡,統(tǒng)計早期凋亡細(xì)胞的百分比(右下象限)。

1.5 Hoechst凋亡試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡

在轉(zhuǎn)染CK18和空載體后的第3天,分別收集細(xì)胞懸液,按說明書對其進(jìn)行Hoechst 33258熒光染色,在熒光顯微鏡下檢測凋亡細(xì)胞,對陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),統(tǒng)計凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics(Version22)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,選擇單樣本t檢驗分析組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CK18真核表達(dá)載體構(gòu)建成功

擴(kuò)增目的基因CK18,其測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對,所得堿基序列與GenBank報道的人CK18基因序列完全一致。將CK18與空真核表達(dá)載體PEGFP-C1連接后經(jīng)XhoⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切后,能夠切出4 700 bp左右的PEGFP-C1載體片段和1 375 bp的CK18基因片段2個條帶(見圖1),酶切后的基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序證實。

2.2 干擾人“三陰”乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α基因的水平

用HIF-1α特異性引物(擴(kuò)增片段長度約為2 749 bp)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后,在HIF-1α shRNA干擾后的MDA-MB-231細(xì)胞中的mRNA表達(dá)有顯著降低;應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測到HIF-1α蛋白在HIF-1α shRNA干擾后的MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)水平明顯降低(見圖2)。

A.RT-PCR檢測HIF-1α水平B.Western blot檢測HIF-1α水平

2.3 CK18轉(zhuǎn)染結(jié)果

轉(zhuǎn)染后24 h,倒置熒光顯微鏡下分別觀察到轉(zhuǎn)染CK18-PEGFP-C1及空載體的HIF-1α shRNA干擾MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)有較強(qiáng)的綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率均約50%。Western blot結(jié)果顯示,CK18蛋白在CK18-PEGFP-C1轉(zhuǎn)染組中表達(dá)水平明顯高于對照轉(zhuǎn)染組(見圖3)。

圖3 Western blot檢測CK18蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)量Figure 3 Protein expression of CK18 in transfected MDA-MB-231 cells

2.4 轉(zhuǎn)染CK18的HIF-1α shRNA干擾MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測情況分析:轉(zhuǎn)染CK18-PEGFP-C1的HIF-1α shRNA干擾MDA-MB-231細(xì)胞與對照轉(zhuǎn)染組在細(xì)胞周期上沒有變化。但Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測分析CK18轉(zhuǎn)染組早期凋亡率高于對照轉(zhuǎn)染組早期凋亡率(4.9%±0.17%vs3.09%±0.25%,見圖4),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A.CK18轉(zhuǎn)染組 B.空載體轉(zhuǎn)染組

Hoechst染色試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況分析:CK18-PEGFP-C1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯多于對照轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡的數(shù)量(見圖5,其中箭頭表示凋亡細(xì)胞)。CK18轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率高于對照轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(53%±11%vs21%±13%,P<0.05)。

A.CK18轉(zhuǎn)染組(箭頭示凋亡細(xì)胞) B.空載體轉(zhuǎn)染組(箭頭示凋亡細(xì)胞)

3 討論

HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體多種腫瘤細(xì)胞中的一種異源二聚體核轉(zhuǎn)錄因子,對維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、血管新生、腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移起作用[6],HIF-1α是其受缺氧信號調(diào)控的亞型。在人“三陰”乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中,隨著缺氧、復(fù)氧的多周期循環(huán),腫瘤細(xì)胞變得更具侵襲性主要是HIF-1α介導(dǎo)的[7]。HIF-1α的表達(dá)升高與乳腺癌患者的不良預(yù)后和低生存率密切相關(guān),以HIF-1α為靶點的臨床藥物開發(fā)可能會為乳腺癌的臨床治療提供新途徑[2]。

CK18是一個重要的中間絲狀體成員,是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要物質(zhì),是上皮細(xì)胞在發(fā)生、成熟、分化過程中逐漸形成的,通常與CK8成對表達(dá)參與細(xì)胞生命活動,維持細(xì)胞的完整性,在應(yīng)激環(huán)境中保護(hù)細(xì)胞,參與重要的細(xì)胞信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為,包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及腫瘤進(jìn)展等[8]。此外,CK18異常地表達(dá)于多種類型的惡性腫瘤，并且與預(yù)后相關(guān)。但CK18在不同腫瘤中表達(dá)的意義是不同的。CK18高表達(dá)于食管癌，并與其不良預(yù)后密切相關(guān)[9];干擾人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的CK18的表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖[10];在肝細(xì)胞癌中CK18表達(dá)升高[11];敲除非小細(xì)胞肺癌的CK18基因可以降低其侵襲力、增加化療敏感性[8]。而與之相反,也有研究顯示,CK18的缺失提示乳腺癌的預(yù)后不良[5];CK18表達(dá)下調(diào)與卵巢癌的不良預(yù)后有關(guān)[12];與前列腺癌的侵襲性增加[13]和臨床高危險度[14]有關(guān)。因此,需要更多的研究來闡明CK18在不同類型癌中的作用。

在“三陰”乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中高表達(dá)的HIF-1α在腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中可誘導(dǎo)多種相關(guān)因子和酶類的表達(dá),促使瘤細(xì)胞突破基底膜。首先完成由上皮表型向間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)變[15],HIF-1α可通過調(diào)控波形蛋白及角蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換[16]。關(guān)于子宮絨毛膜癌的研究指出,過表達(dá)的HIF-1α抑制了上皮細(xì)胞的指標(biāo),如E-CAD,CK18和CK19蛋白的表達(dá)[17]。本課題組前期研究顯示,人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)HIF-1α siRNA干擾后CK18表達(dá)下調(diào)[6]。為進(jìn)一步明確HIF-1α表達(dá)下調(diào)后CK18對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的影響,本研究成功構(gòu)建了CK18-PEGFP-C1真核表達(dá)載體，并使其在HIF-1α干擾后的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，初步證實在沉默HIF-1α的條件下,CK18的過表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。有研究表明,CK18可與CK8協(xié)同調(diào)節(jié)由Fas/TNF家族誘導(dǎo)的凋亡過程[18],這為本課題后續(xù)研究CK18作用于乳腺癌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供了線索。Buhler等[19]和Iyer等[20]的研究顯示,CK18過表達(dá)可以顯著降低人乳腺癌細(xì)胞的侵襲性和生長能力,本課題將繼續(xù)研究CK18對HIF-1α干擾后的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的生物學(xué)影響。

本實驗構(gòu)建的CK18真核表達(dá)載體為進(jìn)一步研究CK18的生物學(xué)功能及對腫瘤細(xì)胞行為學(xué)的影響提供了理想的載體。同時,研究結(jié)果初步提示,以HIF-1α和CK18為聯(lián)合靶點的臨床藥物開發(fā)可能會成為“三陰”乳腺癌臨床治療的新方向。