夏 勇， 薛 灝， 李明洋， 紀 玲

（北京大學深圳醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518036）

《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》（ISO 15189：2012）[1]要求實驗室應對非標準方法檢驗程序進行確認，方法確認應盡可能全面，并通過客觀證據(jù)，即性能特征形式，來證實滿足檢驗預期用途的特定要求。然而，目前我國針對臨床化學自建檢測系統(tǒng)精密度、正確度、準確性、分析測量范圍和臨床可報告范圍等性能確認的具體方法尚未達成共識，針對免疫透射比濁法檢測項目鉤狀效應的性能確認方法就更不多見了。本研究通過對3種非配套IgG試劑的比較，探討免疫透射比濁法自建檢測系統(tǒng)鉤狀效應的性能確認方法。

1 材料和方法

1.1 樣本

收集北京大學深圳醫(yī)院住院患者檢測后的剩余血清，置于-20℃冰箱內(nèi)保存、備用，制備高濃度及低濃度IgG樣本。

1.2 儀器與試劑

AU5400全自動生化分析儀及IMMAGE 800特定蛋白分析儀（美國Beckman-Coulter公司）。3種非配套免疫透射比濁法IgG試劑盒[試劑A（上?？迫A生物工程股份有限公司）、試劑B（北京利德曼生化股份有限公司）、試劑C（德國德賽診斷系統(tǒng)有限公司）]及配套校準品。IMMAGE 800特定蛋白IgG試劑盒及配套校準品。

1.3 方法

1.3.1 儀器參數(shù)設置 3種非配套IgG試劑上機參數(shù)按各廠家說明書要求進行設置，見表1。

表1 3種非配套IgG試劑的上機參數(shù)

1.3.2 不同濃度IgG樣本的制備和檢測 采用IMMAGE 800特定蛋白分析儀對高濃度及低濃度IgG樣本進行檢測。3次檢測結(jié)果的平均值即為高濃度及低濃度樣本的理論濃度（H：70.0 g/L、L：5.5 g/L）。采用AU5400全自動生化分析儀檢測18個濃度梯度的IgG樣本：0（生理鹽水）、0.5L、L、0.1H、0.2H、0.3H、0.4H、0.5H、0.6H、0.7H、0.8H、0.9H、H、1.5H、2H、3H、4H、5H。所有樣本重復檢測3次，記錄檢測結(jié)果、反應A值以及各反應測定點的A值。

1.3.3 Heidel-berger曲線的繪制及安全范圍的比較 繪制3種非配套IgG試劑理論濃度和實測濃度的Heidel-berger曲線，比較不同試劑Heidelberger曲線的平衡點及安全范圍。

1.3.4 鉤狀效應的識別和確認 對AU5400全自動生化分析儀鉤狀效應識別參數(shù)Check Point 1～3（CP1～3）、Limit Point 1～2（LP1～2）、Decision Value 1～3（DV1～3）8個參數(shù)進行設置。比較不同濃度梯度IgG樣本的時間-反應曲線特征，對鉤狀效應5個監(jiān)測時間節(jié)點進行設定。CP1和CP3分別為反應起始點和終點，CP2是抗原抗體反應速率最快點；LP1為反應起始點，LP2為鉤狀效應發(fā)生時A的峰值點。疊加不同濃度抗原的時間-反應曲線，形成劑量-反應曲線，比較從抗原適量到過量的過程中快速反應期內(nèi)A值變化速率及峰值上升幅度的差異，設定鉤狀效應的3個判定值。鉤狀效應判定公式1要求DV1≤（CP2-CP1）/（CP3-CP1）≤DV2，繪制反應速率比與濃度的變化關系圖，以CP2反應完成速率的差異來判斷鉤狀效應是否存在；鉤狀效應判定公式2要求LP2-LP1≥DV3，繪制A峰值上升幅度與濃度的變化關系圖，必要時以LP2 A峰值上升幅度來區(qū)分低濃度反應和鉤狀效應。

1.3.5 識別參數(shù)的確認 重新檢測18個濃度梯度的IgG樣本，對鉤狀效應識別參數(shù)進行確認。

2 結(jié)果

2.1 Heidel-berger曲線及相關參數(shù)

針對抗原過量的情況，試劑C的綜合性能優(yōu)于試劑A，試劑A的綜合性能優(yōu)于試劑B。見圖1、表2。

圖1 3種非配套IgG試劑的Heidel-berger曲線

表2 3種非配套IgG試劑Heidel-berger曲線相關參數(shù)比較 （g/L）

2.2 劑量-反應曲線特征

試劑A低濃度區(qū)A峰值低，在反應曲線中間區(qū)段（18～20點）達到反應平衡；隨著濃度升高A峰值逐漸上升，A值在反應終點前區(qū)段（25～27點）仍隨著時間的延長緩慢上升，且濃度越高，表現(xiàn)越明顯；當出現(xiàn)鉤狀效應時，A峰值下降，在反應終點前仍緩慢上升，與低濃度反應曲線交織在一起。試劑B的A峰值較試劑A低，在正常濃度范圍內(nèi)，反應曲線前區(qū)段（12～15點）即達到反應平衡；出現(xiàn)鉤狀效應時的劑量-反應曲線與試劑A相似。試劑C在正常濃度范圍內(nèi)的劑量-反應曲線與試劑B相似，隨著濃度的升高A峰值上升，較試劑B更加明顯；當出現(xiàn)鉤狀效應時，IgG濃度達到210 g/L之前A峰值繼續(xù)上升，即使IgG濃度達到350 g/L，A峰值仍保持在高位；當發(fā)生鉤狀效應時，A值在12～14點到達峰值后迅速下降，出現(xiàn)特征性“鉤狀效應拐點”。見圖2。

圖2 3種非配套IgG試劑的劑量-反應曲線

2.3 鉤狀效應的識別參數(shù)和確認結(jié)果

3種非配套IgG試劑在10～11點加完試劑2后，A值均迅速上升，試劑A、試劑B、試劑C抗原抗體反應速率最快區(qū)間分別為10～12、10～12和10～11點，分別作為各自的CP1、CP2，將27點即CP3設定為反應終點。當發(fā)生鉤狀效應時，試劑A、試劑B A峰值出現(xiàn)在27點，試劑C A峰值出現(xiàn)在13點。試劑A通過公式1的反應速率比0＜（A12-A10）/（A27-A10）＜0.6即可區(qū)分是否存在鉤狀效應；試劑C與試劑A相似，存在抗原過量的鉤狀效應（A12-A10）/（A27-A10）＞0.87；試劑B從抗原適量到過量的過程中，無論是快速反應期內(nèi)的A值變化速率還是A峰值上升幅度的差異均未得到有效區(qū)分，鉤狀效應的識別濃度范圍尚未超出其安全范圍。設定上述鉤狀效應的識別參數(shù)后，重新檢測18個濃度梯度的IgG樣本，再次確認，得到3種非配套IgG試劑（試劑A、試劑B、試劑C）鉤狀效應報警的濃度范圍分別為49～350、28～70、42～350 g/L。見表3、圖3、圖4。

表3 3種非配套IgG試劑鉤狀效應識別參數(shù)的比較

圖3 3種非配套IgG試劑反應速率比與濃度變化的關系

圖4 3種非配套IgG試劑A峰值上升幅度與濃度變化的關系

3 討論

免疫透射比濁法定量檢測的原理是當抗原與抗體比例合適時，A值會出現(xiàn)隨著抗原濃度的上升而上升的現(xiàn)象。實驗室通過分析測量范圍確認試驗，可發(fā)現(xiàn)高濃度區(qū)域的線性偏離以及抗原過量等問題。一旦樣本中抗原濃度繼續(xù)升高，超出其安全范圍，就會出現(xiàn)鉤狀效應，導致無任何報警提示的負偏差結(jié)果出現(xiàn)。即使在封閉的免疫透射比濁法特定蛋白分析儀上設置鉤狀效應檢查程序，也會出現(xiàn)因抗原過量而導致結(jié)果假性偏低的情況發(fā)生[2-3]。由此可見，鉤狀效應是免疫透射比濁法與免疫散射比濁法共同面臨的一個問題，鉤狀效應的確認是檢測結(jié)果準確的質(zhì)量保證[4]。

特定蛋白開放檢測系統(tǒng)（非標準檢驗程序）通過分析測量范圍確認試驗，利用全自動生化分析儀上的“線性檢測功能”，可發(fā)現(xiàn)高濃度區(qū)域線性偏離以及抗原過量問題。通過繪制Heidel-berger曲線，確定不同試劑反應的平衡點（A峰值對應的濃度為抗原過量拐點）、后帶限（劑量-反應曲線右側(cè)與分析測量范圍上限A值相等的濃度點）及抗原過量的安全范圍（分析測量范圍上限至后帶限之間），可反映各試劑中抗體的含量、親和力及效價水平，并可有效評價特定蛋白檢測試劑盒的綜合性能。Heidel-berger曲線結(jié)果表明，適當降低分析測量范圍上限，可有效擴大其安全濃度范圍。如將本研究試劑C的分析測量范圍上限從35 g/L下調(diào)至33 g/L，其安全范圍上限可提升到120 g/L，即可基本滿足臨床上大多數(shù)IgG的病理濃度分布。進一步比較3種非配套IgG試劑的鉤狀效應劑量-反應曲線特征可發(fā)現(xiàn)有“峰降緩升”型和“峰高快降”2種類型?！胺褰稻徤毙途唧w表現(xiàn)為：劑量-反應曲線的A峰值明顯下降，劑量-反應曲線與低濃度反應曲線交織在一起，但反應終點前A值仍緩慢上升。該型可利用A值在反應終點前的“緩升”與低濃度進行區(qū)分，并可利用A值“峰降”與正常高濃度進行區(qū)分，本研究中的試劑A、試劑B均為此型?！胺甯呖旖怠毙途唧w表現(xiàn)為：劑量-反應曲線到達A峰值時間提前，A峰值保持在高位，A值到達峰值后快速下降，下降持續(xù)到終點前，本研究中試劑C為此型[5]?！胺甯呖旖怠毙托鑼^狀效應判定公式2中的LP2設定在“鉤狀效應拐點”上，而非正常反應終點。

本研究通過對比不同試劑鉤狀效應識別參數(shù)發(fā)現(xiàn)，并不是所有試劑都能找到合適的報警閾值。試劑B可能因抗體的量或效價不足，當使用當前設置的報警參數(shù)時，并不能完全實現(xiàn)有效報警。因極端高濃度樣本難以獲取，故本研究以增加樣本量的方式來建立報警參數(shù)，研究結(jié)果可能與真實的高濃度樣本反應曲線特征存在一定的差異。此外，由于不同廠家的特定蛋白檢測試劑盒之間存在一定的批間差，因此不同試劑批次之間可能會存在報警參數(shù)差異，故在識別參數(shù)建立過程中，可降低報警閾值，以提高敏感性。

本研究通過對3種非配套IgG試劑進行比較，初步探討了免疫透射比濁法鉤狀效應性能確認方法，即繪制覆蓋病理濃度范圍的Heidelberger曲線，確定安全范圍及平衡點；觀察時間-反應曲線，確定A值到達峰值的時間點，通過抗原抗體快速反應期A值變化的速率，確定鉤狀效應的監(jiān)測點；判斷鉤狀效應劑量-反應曲線類型，比較從抗原適量到過量的過程中，快速反應期內(nèi)A值變化速率、達到峰值時間及上升幅度的差異，確定鉤狀效應監(jiān)測的判定值；模擬不同濃度的樣本對自建檢測系統(tǒng)鉤狀效應的識別參數(shù)進行確認，當涉及試劑批號改變時，需再次對設定參數(shù)進行驗證。