夏 勇， 薛 灝， 李明洋， 紀(jì) 玲

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518036）

《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO 15189：2012）[1]要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對非標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)程序進(jìn)行確認(rèn)，方法確認(rèn)應(yīng)盡可能全面，并通過客觀證據(jù)，即性能特征形式，來證實(shí)滿足檢驗(yàn)預(yù)期用途的特定要求。然而，目前我國針對臨床化學(xué)自建檢測系統(tǒng)精密度、正確度、準(zhǔn)確性、分析測量范圍和臨床可報(bào)告范圍等性能確認(rèn)的具體方法尚未達(dá)成共識，針對免疫透射比濁法檢測項(xiàng)目鉤狀效應(yīng)的性能確認(rèn)方法就更不多見了。本研究通過對3種非配套IgG試劑的比較，探討免疫透射比濁法自建檢測系統(tǒng)鉤狀效應(yīng)的性能確認(rèn)方法。

1 材料和方法

1.1 樣本

收集北京大學(xué)深圳醫(yī)院住院患者檢測后的剩余血清，置于-20℃冰箱內(nèi)保存、備用，制備高濃度及低濃度IgG樣本。

1.2 儀器與試劑

AU5400全自動生化分析儀及IMMAGE 800特定蛋白分析儀（美國Beckman-Coulter公司）。3種非配套免疫透射比濁法IgG試劑盒[試劑A（上?？迫A生物工程股份有限公司）、試劑B（北京利德曼生化股份有限公司）、試劑C（德國德賽診斷系統(tǒng)有限公司）]及配套校準(zhǔn)品。IMMAGE 800特定蛋白IgG試劑盒及配套校準(zhǔn)品。

1.3 方法

1.3.1 儀器參數(shù)設(shè)置 3種非配套IgG試劑上機(jī)參數(shù)按各廠家說明書要求進(jìn)行設(shè)置，見表1。

表1 3種非配套IgG試劑的上機(jī)參數(shù)

1.3.2 不同濃度IgG樣本的制備和檢測 采用IMMAGE 800特定蛋白分析儀對高濃度及低濃度IgG樣本進(jìn)行檢測。3次檢測結(jié)果的平均值即為高濃度及低濃度樣本的理論濃度（H：70.0 g/L、L：5.5 g/L）。采用AU5400全自動生化分析儀檢測18個濃度梯度的IgG樣本：0（生理鹽水）、0.5L、L、0.1H、0.2H、0.3H、0.4H、0.5H、0.6H、0.7H、0.8H、0.9H、H、1.5H、2H、3H、4H、5H。所有樣本重復(fù)檢測3次，記錄檢測結(jié)果、反應(yīng)A值以及各反應(yīng)測定點(diǎn)的A值。

1.3.3 Heidel-berger曲線的繪制及安全范圍的比較 繪制3種非配套IgG試劑理論濃度和實(shí)測濃度的Heidel-berger曲線，比較不同試劑Heidelberger曲線的平衡點(diǎn)及安全范圍。

1.3.4 鉤狀效應(yīng)的識別和確認(rèn) 對AU5400全自動生化分析儀鉤狀效應(yīng)識別參數(shù)Check Point 1～3（CP1～3）、Limit Point 1～2（LP1～2）、Decision Value 1～3（DV1～3）8個參數(shù)進(jìn)行設(shè)置。比較不同濃度梯度IgG樣本的時間-反應(yīng)曲線特征，對鉤狀效應(yīng)5個監(jiān)測時間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行設(shè)定。CP1和CP3分別為反應(yīng)起始點(diǎn)和終點(diǎn)，CP2是抗原抗體反應(yīng)速率最快點(diǎn)；LP1為反應(yīng)起始點(diǎn)，LP2為鉤狀效應(yīng)發(fā)生時A的峰值點(diǎn)。疊加不同濃度抗原的時間-反應(yīng)曲線，形成劑量-反應(yīng)曲線，比較從抗原適量到過量的過程中快速反應(yīng)期內(nèi)A值變化速率及峰值上升幅度的差異，設(shè)定鉤狀效應(yīng)的3個判定值。鉤狀效應(yīng)判定公式1要求DV1≤（CP2-CP1）/（CP3-CP1）≤DV2，繪制反應(yīng)速率比與濃度的變化關(guān)系圖，以CP2反應(yīng)完成速率的差異來判斷鉤狀效應(yīng)是否存在；鉤狀效應(yīng)判定公式2要求LP2-LP1≥DV3，繪制A峰值上升幅度與濃度的變化關(guān)系圖，必要時以LP2 A峰值上升幅度來區(qū)分低濃度反應(yīng)和鉤狀效應(yīng)。

1.3.5 識別參數(shù)的確認(rèn) 重新檢測18個濃度梯度的IgG樣本，對鉤狀效應(yīng)識別參數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 Heidel-berger曲線及相關(guān)參數(shù)

針對抗原過量的情況，試劑C的綜合性能優(yōu)于試劑A，試劑A的綜合性能優(yōu)于試劑B。見圖1、表2。

圖1 3種非配套IgG試劑的Heidel-berger曲線

表2 3種非配套IgG試劑Heidel-berger曲線相關(guān)參數(shù)比較 （g/L）

2.2 劑量-反應(yīng)曲線特征

試劑A低濃度區(qū)A峰值低，在反應(yīng)曲線中間區(qū)段（18～20點(diǎn)）達(dá)到反應(yīng)平衡；隨著濃度升高A峰值逐漸上升，A值在反應(yīng)終點(diǎn)前區(qū)段（25～27點(diǎn)）仍隨著時間的延長緩慢上升，且濃度越高，表現(xiàn)越明顯；當(dāng)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)時，A峰值下降，在反應(yīng)終點(diǎn)前仍緩慢上升，與低濃度反應(yīng)曲線交織在一起。試劑B的A峰值較試劑A低，在正常濃度范圍內(nèi)，反應(yīng)曲線前區(qū)段（12～15點(diǎn)）即達(dá)到反應(yīng)平衡；出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)時的劑量-反應(yīng)曲線與試劑A相似。試劑C在正常濃度范圍內(nèi)的劑量-反應(yīng)曲線與試劑B相似，隨著濃度的升高A峰值上升，較試劑B更加明顯；當(dāng)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)時，IgG濃度達(dá)到210 g/L之前A峰值繼續(xù)上升，即使IgG濃度達(dá)到350 g/L，A峰值仍保持在高位；當(dāng)發(fā)生鉤狀效應(yīng)時，A值在12～14點(diǎn)到達(dá)峰值后迅速下降，出現(xiàn)特征性“鉤狀效應(yīng)拐點(diǎn)”。見圖2。

圖2 3種非配套IgG試劑的劑量-反應(yīng)曲線

2.3 鉤狀效應(yīng)的識別參數(shù)和確認(rèn)結(jié)果

3種非配套IgG試劑在10～11點(diǎn)加完試劑2后，A值均迅速上升，試劑A、試劑B、試劑C抗原抗體反應(yīng)速率最快區(qū)間分別為10～12、10～12和10～11點(diǎn)，分別作為各自的CP1、CP2，將27點(diǎn)即CP3設(shè)定為反應(yīng)終點(diǎn)。當(dāng)發(fā)生鉤狀效應(yīng)時，試劑A、試劑B A峰值出現(xiàn)在27點(diǎn)，試劑C A峰值出現(xiàn)在13點(diǎn)。試劑A通過公式1的反應(yīng)速率比0＜（A12-A10）/（A27-A10）＜0.6即可區(qū)分是否存在鉤狀效應(yīng)；試劑C與試劑A相似，存在抗原過量的鉤狀效應(yīng)（A12-A10）/（A27-A10）＞0.87；試劑B從抗原適量到過量的過程中，無論是快速反應(yīng)期內(nèi)的A值變化速率還是A峰值上升幅度的差異均未得到有效區(qū)分，鉤狀效應(yīng)的識別濃度范圍尚未超出其安全范圍。設(shè)定上述鉤狀效應(yīng)的識別參數(shù)后，重新檢測18個濃度梯度的IgG樣本，再次確認(rèn)，得到3種非配套IgG試劑（試劑A、試劑B、試劑C）鉤狀效應(yīng)報(bào)警的濃度范圍分別為49～350、28～70、42～350 g/L。見表3、圖3、圖4。

表3 3種非配套IgG試劑鉤狀效應(yīng)識別參數(shù)的比較

圖3 3種非配套IgG試劑反應(yīng)速率比與濃度變化的關(guān)系

圖4 3種非配套IgG試劑A峰值上升幅度與濃度變化的關(guān)系

3 討論

免疫透射比濁法定量檢測的原理是當(dāng)抗原與抗體比例合適時，A值會出現(xiàn)隨著抗原濃度的上升而上升的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)室通過分析測量范圍確認(rèn)試驗(yàn)，可發(fā)現(xiàn)高濃度區(qū)域的線性偏離以及抗原過量等問題。一旦樣本中抗原濃度繼續(xù)升高，超出其安全范圍，就會出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，導(dǎo)致無任何報(bào)警提示的負(fù)偏差結(jié)果出現(xiàn)。即使在封閉的免疫透射比濁法特定蛋白分析儀上設(shè)置鉤狀效應(yīng)檢查程序，也會出現(xiàn)因抗原過量而導(dǎo)致結(jié)果假性偏低的情況發(fā)生[2-3]。由此可見，鉤狀效應(yīng)是免疫透射比濁法與免疫散射比濁法共同面臨的一個問題，鉤狀效應(yīng)的確認(rèn)是檢測結(jié)果準(zhǔn)確的質(zhì)量保證[4]。

特定蛋白開放檢測系統(tǒng)（非標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序）通過分析測量范圍確認(rèn)試驗(yàn)，利用全自動生化分析儀上的“線性檢測功能”，可發(fā)現(xiàn)高濃度區(qū)域線性偏離以及抗原過量問題。通過繪制Heidel-berger曲線，確定不同試劑反應(yīng)的平衡點(diǎn)（A峰值對應(yīng)的濃度為抗原過量拐點(diǎn)）、后帶限（劑量-反應(yīng)曲線右側(cè)與分析測量范圍上限A值相等的濃度點(diǎn)）及抗原過量的安全范圍（分析測量范圍上限至后帶限之間），可反映各試劑中抗體的含量、親和力及效價水平，并可有效評價特定蛋白檢測試劑盒的綜合性能。Heidel-berger曲線結(jié)果表明，適當(dāng)降低分析測量范圍上限，可有效擴(kuò)大其安全濃度范圍。如將本研究試劑C的分析測量范圍上限從35 g/L下調(diào)至33 g/L，其安全范圍上限可提升到120 g/L，即可基本滿足臨床上大多數(shù)IgG的病理濃度分布。進(jìn)一步比較3種非配套IgG試劑的鉤狀效應(yīng)劑量-反應(yīng)曲線特征可發(fā)現(xiàn)有“峰降緩升”型和“峰高快降”2種類型。“峰降緩升”型具體表現(xiàn)為：劑量-反應(yīng)曲線的A峰值明顯下降，劑量-反應(yīng)曲線與低濃度反應(yīng)曲線交織在一起，但反應(yīng)終點(diǎn)前A值仍緩慢上升。該型可利用A值在反應(yīng)終點(diǎn)前的“緩升”與低濃度進(jìn)行區(qū)分，并可利用A值“峰降”與正常高濃度進(jìn)行區(qū)分，本研究中的試劑A、試劑B均為此型。“峰高快降”型具體表現(xiàn)為：劑量-反應(yīng)曲線到達(dá)A峰值時間提前，A峰值保持在高位，A值到達(dá)峰值后快速下降，下降持續(xù)到終點(diǎn)前，本研究中試劑C為此型[5]。“峰高快降”型需將鉤狀效應(yīng)判定公式2中的LP2設(shè)定在“鉤狀效應(yīng)拐點(diǎn)”上，而非正常反應(yīng)終點(diǎn)。

本研究通過對比不同試劑鉤狀效應(yīng)識別參數(shù)發(fā)現(xiàn)，并不是所有試劑都能找到合適的報(bào)警閾值。試劑B可能因抗體的量或效價不足，當(dāng)使用當(dāng)前設(shè)置的報(bào)警參數(shù)時，并不能完全實(shí)現(xiàn)有效報(bào)警。因極端高濃度樣本難以獲取，故本研究以增加樣本量的方式來建立報(bào)警參數(shù)，研究結(jié)果可能與真實(shí)的高濃度樣本反應(yīng)曲線特征存在一定的差異。此外，由于不同廠家的特定蛋白檢測試劑盒之間存在一定的批間差，因此不同試劑批次之間可能會存在報(bào)警參數(shù)差異，故在識別參數(shù)建立過程中，可降低報(bào)警閾值，以提高敏感性。

本研究通過對3種非配套IgG試劑進(jìn)行比較，初步探討了免疫透射比濁法鉤狀效應(yīng)性能確認(rèn)方法，即繪制覆蓋病理濃度范圍的Heidelberger曲線，確定安全范圍及平衡點(diǎn)；觀察時間-反應(yīng)曲線，確定A值到達(dá)峰值的時間點(diǎn)，通過抗原抗體快速反應(yīng)期A值變化的速率，確定鉤狀效應(yīng)的監(jiān)測點(diǎn)；判斷鉤狀效應(yīng)劑量-反應(yīng)曲線類型，比較從抗原適量到過量的過程中，快速反應(yīng)期內(nèi)A值變化速率、達(dá)到峰值時間及上升幅度的差異，確定鉤狀效應(yīng)監(jiān)測的判定值；模擬不同濃度的樣本對自建檢測系統(tǒng)鉤狀效應(yīng)的識別參數(shù)進(jìn)行確認(rèn)，當(dāng)涉及試劑批號改變時，需再次對設(shè)定參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。