周 鋼， 鐘 焱

（ 1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，湖南 長沙 410078；2. 長江衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410100）

鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）是人類最重要的原癌基因之一，含18個外顯子和17個內(nèi)含子，定位于染色體7q34，長約190 kb，是一種鳥苷酸結(jié)合蛋白活化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細胞、分裂和分化的有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activiated protein kinese，MAPK）信號通路方面具有重要作用。BRAF基因發(fā)生突變后會促進細胞的有絲分裂，導(dǎo)致細胞異常增殖和分化。其突變類型主要有2種：一是位于11號外顯子的G463/G465/G468突變，二是位于15號外顯子的V600E突變[基因序列的1799位T突變?yōu)锳或C，導(dǎo)致核苷酸序列第600位的纈氨酸（V）被谷氨酸（E）替代]，其中后者占80%以上。目前臨床上的BRAF抑制劑類靶向藥物（威羅菲尼、西妥昔單抗、帕尼單抗）對BRAF尤其發(fā)生了V600E突變的癌癥有很高的活性抑制作用。BRAF基因的突變情況與癌癥治療效果密切相關(guān)，YOKOTA等[1]通過研究發(fā)現(xiàn)，BRAF基因的突變是晚期及復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌最重要的預(yù)后指標之一，與患者的總體生存期密切相關(guān)。通過基因檢測分析患者癌細胞中該基因的突變情況及突變比例，可指導(dǎo)癌癥患者的臨床用藥，減少患者用藥后的副作用，是臨床安全、合理用藥的重要參考指標。

基于酶級聯(lián)反應(yīng)的焦磷酸測序（pyrosequencing，PYRO）技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，其原理為：測序引物與檢測樣本的DNA模板退火后，在4種酶（DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）的共同作用下，將每一個脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP）的聚合與熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過儀器檢測其熒光強度而實時測定DNA序列的每一個堿基，并生成一定的峰值。此方法操作簡便、靈敏度高，非常適合已知序列的短片段測序，是單核苷酸多態(tài)性、甲基化與腫瘤患者體細胞突變檢測的理想檢測技術(shù)，已逐漸被應(yīng)用于預(yù)防藥物不良反應(yīng)、腫瘤靶向藥物用藥指導(dǎo)、遺傳性疾病診斷等方面并日趨成熟。本研究擬建立快速、簡便、高效檢測體細胞BRAF基因V600E突變的PYRO方法，并驗證該技術(shù)的可行性及準確性。

1 材料和方法

1.1 儀器

Qigene pyro24測序儀（德國凱杰公司）、7500 PCR擴增儀（美國ABI公司）等。

1.2 試劑

Purelink Genomic DNA Mini Kit（美國Invitrogen公司），PyroMarkTM Gold Q96 SQA Reagents Kit（德國凱杰公司），PCR amplification kit（大連Takara公司），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物和測序引物由生工生物工程（上海）股份有限公司純化合成，瓊脂糖凝膠電泳核酸染料Gel-Red由碧云天生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 DNA提取

將收集的100例結(jié)直腸癌石蠟包埋組織，按照組織樣本基因組DNA試劑盒說明書提取組織樣本中的全基因組DNA，用于檢測BRAF基因突變。

1.4 PCR擴增

利用PCR引物設(shè)計軟件Prime 5.0以BRAF第600位密碼子上下游序列為DNA模板，設(shè)計PCR擴增引物和測序引物，經(jīng)Blast比對序列分析準確無誤后送生工生物工程（上海）股份有限公司純化和合成，其中下游序列用5'生物素標記（表1）。BRAF基因PCR擴增的體系為：gDNA 2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 1.5 μL，BrafPyro F 0.5 μL，BrafPyorBioR 0.5 μL，rTaq 0.5 μL，無核酶水40 μL。擴增條件為：95 ℃，5 min；95 ℃?30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保溫。所有擴增樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增質(zhì)量。

表1 BRAF V600E突變PYRO測序PCR擴增引物及測序引物

1.5 PYRO方法的建立

取15～20 μL PCR擴增產(chǎn)物進行PYRO，每孔中加入38 μL結(jié)合緩沖液，2 μL生物素-鏈霉親和素瓊脂糖凝膠微珠，2 000×g震蕩混勻，孵育5～10 min。按PYRO操作步驟，經(jīng)變性及洗滌后，將變性后僅有生物素標記的DNA單鏈釋放到退火緩沖液中，將反應(yīng)板置于80℃的恒溫箱中孵育2 min后，再室溫冷卻5 min，按照Qigene pyro24測序儀的操作說明設(shè)定檢測程序，在反應(yīng)孔中加入PYRO反應(yīng)所需的酶混合物（E）、熒光底物（S）和dNTP，將反應(yīng)板放入檢測位置進行檢測。

1.6 重復(fù)性試驗和測序驗證

任意選取20例結(jié)直腸癌組織樣本DNA在1周內(nèi)重復(fù)檢測3次，對比分析檢測結(jié)果的一致性。并隨機抽取不同突變型的BRAF DNA樣本，PCR擴增后進行Sanger測序，驗證所建立的PYRO方法的準確性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物質(zhì)量分析

溫度對PCR的擴增非常重要，擴增產(chǎn)物的質(zhì)量會影響PYRO的成敗。本研究對BRAF V600E突變的PCR擴增進行了溫度梯度實驗，同時將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，將樣本的DNA模板進行PCR擴增，得到BRAF V600E突變的PCR擴增產(chǎn)物大小為126 bp PCR產(chǎn)物為120+bp，為BRAF V600E突變的特異性產(chǎn)物，其PCR的最佳擴增溫度為56.7 ℃。見圖1。

2.2 PYRO結(jié)果與重復(fù)性驗證

對100例樣本進行了BRAF V600E突變的PYRO，成功率100%，檢出率100%，其中V600E（T＞A）突變樣本6例，突變比率為6%。每個樣本PCR擴增質(zhì)量均較高，PYRO的堿基單峰信號值均超過30，堿基檢測峰的位置及峰高與待測序列完全相符，多態(tài)位點基因型可以清晰判斷，見圖2。Sanger測序分型結(jié)果與PYRO一致，20例樣本的2次重復(fù)實驗結(jié)果一致，隨機抽樣的Sanger測序結(jié)果與PYRO分析結(jié)果完全相符，見圖3。

圖1 PCR溫度梯度實驗瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 BRAF V600E位點PYRO結(jié)果

圖3 BRAF V600E位點Sanger測序結(jié)果

3 討論

基于中南大學(xué)臨床藥理研究所臨床檢測中心的PYRO平臺，本研究建立了BRAF基因V600E突變檢測的PYRO技術(shù)，通過重復(fù)性試驗和Sanger測序法驗證，該方法準確可靠。

隨著臨床藥理遺傳學(xué)的發(fā)展，目前常見的基因突變分析技術(shù)很多，大多以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，主要有直接測序法、擴增阻礙突變系統(tǒng)法、PRYO、轉(zhuǎn)移終止引物延伸法、實時熒光定量PCR、高分辨率通解度曲線法、突變富集液相芯片法等，各種方法均有優(yōu)勢和缺點。PYRO技術(shù)是一種全新的核酸序列分析技術(shù)，其通過熒光信號種類和強度，可定性或定量檢測各種等位基因型，可同時檢測96個體系，且每個體系的檢測位點不同，具有很大的檢測靈活性[2]。與傳統(tǒng)的直接測序技術(shù)相比，具有通量高、效率高、精讀范圍大、準確度高、方向多元、可檢測低質(zhì)量樣本等優(yōu)點，可檢索已知和未知突變。傳統(tǒng)的直接測序法靈敏度較低，檢測基因點突變比例的下限為10%左右，而PRYO技術(shù)的檢測下限可低至5%。此外，直接測序法通過正反雙向測序進行比較，PCR擴增產(chǎn)物需先進行分離純化，檢測步驟繁瑣、檢測周期長、易污染、檢測錯誤概率高。擴增阻礙突變系統(tǒng)法應(yīng)用也較為廣泛，該方法靈敏度高、檢測周期短，但需要特殊引物探針，每次僅能檢測1種突變，不同的突變必須進行不同的檢測，對于突變類型較多的位點（如EGFR19）則不適用，檢測成本相對較高。高分辨率通解度曲線法也可檢測所有類型的突變，但相對較復(fù)雜、操作繁瑣。高分辨率通解度曲線法的靈敏高達0.1%[3]，但檢測成本遠遠高于PYRO法，且只能檢測已知的突變類型。實時熒光定量PCR的靈敏度較高、檢測周期也較短，但其檢測成本也高于PYRO技術(shù)，只能檢測已知的突變類型[4-5]。

BRAF是一種癌基因，編碼一種絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶，是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細胞內(nèi)多種信號通路[6-7]。在多種惡性腫瘤（惡性黑色素瘤、結(jié)直腸、肺、甲狀腺、肝及胰腺等）中均存在不同比例的BRAF基因突變[8]。易文君等[9]研究發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。朱琰琰等[10]采用PCR擴增和直接測序方法檢測我國惡性黑色素瘤患者腫瘤組織中BRAF外顯子11和15的突變情況，發(fā)現(xiàn)黏膜、肢端和非肢端皮膚黑色素瘤患者BRAF基因的突變率分別為23.3%、16.7%和43.3%。BRAF基因在中國人非肢端皮膚黑色素瘤中突變率較高，且以該基因第15外顯子V600E點突變?yōu)橹鱗11]。有學(xué)者應(yīng)用熒光PCR-優(yōu)化寡核苷酸探針法檢測304例結(jié)直腸癌石蠟包埋樣本中BRAF基因的15號外顯子的突變情況，發(fā)現(xiàn)BRAF基因在結(jié)直腸癌的突變率為4.3%，且BRAF基因突變與腫瘤部位、病理類型和分化程度有關(guān)[12-13]。BRAF V600E突變指BRAF基因mRNA序列的第1799個核苷酸的堿基T突變?yōu)锳，導(dǎo)致第600個密碼子編碼的谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸。此位點突變與昔妥西單抗的低反應(yīng)率密切相關(guān)，BRAF蛋白V600E突變也可以導(dǎo)致對索拉非尼的耐藥。由BRAF基因的突變引起的轉(zhuǎn)運能力的改變與藥物臨床應(yīng)用及藥物不良反應(yīng)關(guān)系密切，因此根據(jù)患者遺傳背景，進行個體化給藥，是保證臨床合理、安全用藥，避免藥物不良反應(yīng)的有效途徑之一[14]。

本研究建立的體細胞BRAF基因V600E突變的PYRO檢測方法，通過重復(fù)性實驗和測序結(jié)果驗證，其檢測準確率為100%，可作為科研或臨床中BRAF基因V600E突變檢測的一種新的方法。