張景皓，楊 峰，方 毅，楊麗華，劉文健，趙 虎，張艷梅

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗科，上海 200040；2.上海市松江區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 201620）

急性感染性腹瀉是臨床常見的腸道感染性疾病之一，在我國具有較高的發(fā)病率[1]。導(dǎo)致急性感染性腹瀉的病原菌種類較多，包括各種腸道病原菌、腸道病毒和部分真菌及原蟲等。沙門菌是導(dǎo)致人類食源性急性腹瀉最常見的病原菌[2-3]。由于急性感染性腹瀉發(fā)病快，多數(shù)患者病程較短，而細菌培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感性試驗時間較長，所以臨床上多以經(jīng)驗用藥為主，導(dǎo)致耐藥菌株增加、療效差和腸道微生態(tài)失衡，進而引發(fā)多種并發(fā)癥[1，4]。有研究發(fā)現(xiàn)，沙門菌攜帶的耐藥基因中，β-內(nèi)酰胺酶類耐藥以blaTEM-1為主，喹諾酮耐藥主要由gyrA和parC點突變引起[5-6]，磺胺類耐藥基因是sulⅠ[7]，而aph（3）-Ⅱa是氨基糖苷類耐藥基因的代表之一[8]。本研究分析了分離自400例急性感染性腹瀉患者糞便樣本的22株沙門菌，檢測其藥物敏感性及相關(guān)耐藥基因的攜帶情況，以了解地區(qū)差異，為臨床的精準診療提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2016年5月—2017年4月華東醫(yī)院急性感染性腹瀉患者糞便樣本52例、上海市松江區(qū)疾病預(yù)防控制中心急性感染性腹瀉患者糞便樣本348例，共400例。

1.2 儀器與試劑

Vitek MS 儀、Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）及配套藥敏板條，環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢呋辛、頭孢西丁和頭孢噻肟E-test試劑條購自英國Oxoid公司。血瓊脂平板、SS平板和M-H平板購自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司。沙門菌血清學(xué)分型采用丹麥SSI公司生產(chǎn)的鑒定血清。校準菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）由法國生物梅里埃公司提供，質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922、ATCC3 5218）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）由上海市臨床檢驗中心提供。TIANamp Bacteria DNA Ki購自天根生化科技（北京）有限公司，Veriti 96 PCR儀購自美國ABI公司，引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離培養(yǎng) 挑取糞便樣本，接種于SS平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，直至形成中等大小、透明或半透明可疑菌落。

1.3.2 菌種鑒定 采用Vitek MS 儀進行菌種檢測。挑取單個菌落均勻涂布于靶板上，加入1 uL基質(zhì)（α氰基-4-羥基肉桂酸），室溫干燥后上機檢測。嚴格按照儀器說明書進行操作。鑒定結(jié)果可信度均為99.9%。

1.3.3 血清學(xué)分型 將分離培養(yǎng)陽性的沙門菌轉(zhuǎn)種于血平板進行分純和傳代培養(yǎng)。血清凝集實驗的操作按照如下步驟進行：懸空滴加1滴抗血清于載玻片上，用冷卻后的滅菌接種環(huán)挑取適量生長狀態(tài)良好的待檢細菌，均勻涂布在抗血清中，小幅度晃動載玻片，1 min內(nèi)觀察是否有凝集出現(xiàn)。血清凝集順序為從多價到單價，從常見血清型到少見血清型。

1.3.4 藥物敏感性試驗 采用Vitek 2 Compact藥敏板條，并補充5種臨床常用抗菌藥物（環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢呋辛、頭孢西丁和頭孢噻肟）E-test試劑條進行藥物敏感性試驗。參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會2016 年版判讀標準判定結(jié)果[9]。

1.3.5 相關(guān)耐藥基因檢測 采用檢測β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM-1、blaCMY-2、blaPSE-1，磺胺類耐藥基因sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ，氨基糖苷類耐藥基因aph（3'）-Ⅱ a、aadA1、aadB、strB，喹諾酮類耐藥基因qyrA、qnrB、parC。目的基因引物序列和目的片段長度見表1。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積25 μL，2xTaq PCR Master Mix 12.5 μL，正、反向引物各1 μL，模板2 μL，最后用ddH2O補至總體積25 μL[8]。

表1 耐藥基因引物序列和目的片段長度

2 結(jié)果

2.1 沙門菌分離率和血清分型

剔除了分離自同一患者的重復(fù)菌株，從400例糞便樣本中分離到22株沙門菌，陽性分離率為5.5%。對22株沙門菌進行血清學(xué)分型檢測，檢出率最高的血清型依次為鼠傷寒沙門菌（36.4%，8/22）、腸炎沙門菌（27.3%，6/22）和倫敦沙門菌（18.2%，4/22），德比沙門菌、湯普森沙門菌、紐波特沙門菌和吉偉沙門菌各檢出1株（4.5%，1/22）。

2.2 體外藥物敏感性試驗

沙門菌整體耐藥率較高，其中氨芐西林-舒巴坦最高（95.5%），以下依次為氨芐西林、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星-頭孢噻肟-慶大霉素、頭孢唑林-頭孢呋辛-頭孢他啶、阿米卡星。雖然環(huán)丙沙星較左氧氟沙星耐藥率低，但其中介率可達63.6%。哌拉西林-他唑巴坦、亞胺培南敏感率100%。見表2。

對不同血清型沙門菌耐藥情況進行分析，結(jié)果顯示，不同血清型沙門菌的耐藥情況分布較均一，兩者間并未出現(xiàn)明顯的相關(guān)性。

表2 沙門菌藥物敏感性試驗結(jié)果 [例（%）]

2.3 相關(guān)耐藥基因的檢測

β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM-1和DHA僅在耐藥菌株中被檢測到，檢出率均為23.8%（5/21），blaCTX-M1、blaCTX-M2、 blaCTX-M8、blaCTX-M9、blaSHV、blaCMY-2和blaPSE-1基因在所有菌株中均未被檢測到?；前奉惸退幓騭ulⅠ和sulⅢ僅在耐藥株中被檢測到，檢出率分別為66.7%（4/6）和16.7%（1/6），而sul Ⅱ基因僅在敏感株中被檢測到，檢出率為6.25%（1/16）。氨基糖苷類耐藥基因aadA1在耐藥株中的檢出率為25%（1/4），aph（3'）-Ⅱa、aadA1、aadB和strB基因未在耐藥菌株中被檢測到，但在敏感株中檢出率分別為5.6%（1/18）、22.2%（4/18）、5.6%（1/18）和50.0%（9/18）。喹諾酮類耐藥基因qyrA、qnrB、parC和qnrS均只在耐藥株中被檢測到，檢出率分別為47.1%、11.7%、58.8%和17.6%；qnrA在耐藥菌株中的檢出率為5.9%，其在敏感菌株中也被檢出1例；qnrC未被檢出。見表3。

表3 沙門菌耐藥基因測序結(jié)果及檢出率

3 討論

本研究從收集到的400例臨床糞便樣本中分離出22株沙門菌，分離率為5.5%，同其他地區(qū)報道的沙門菌分離率基本一致[11]。目前臨床多將喹諾酮類藥物作為對細菌感染性腹瀉經(jīng)驗用藥的首選抗菌藥物，將磺胺類藥物作為次選藥物[1，12]。然而本研究通過對22株分離自急性感染性腹瀉患者糞便樣本中的沙門菌進行15種臨床常用抗菌藥物的藥物敏感性試驗后發(fā)現(xiàn)，沙門菌對氨芐西林-舒巴坦、氨芐西林和左氧氟沙星的耐藥率分別高達95.5%、81.8%和77.3%，對復(fù)方磺胺甲噁唑及慶大霉素的耐藥率也高達27.3%和18.2%，與國內(nèi)其他報導(dǎo)有較大的差異[5，7，13]。提示在臨床用藥時應(yīng)注意本地區(qū)沙門菌的耐藥譜，并進行精準檢測和分析，同時建議各地建立自己的耐藥監(jiān)測網(wǎng)，以指導(dǎo)臨床用藥。

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的主要作用機制為結(jié)合細菌細胞膜內(nèi)膜上的靶位蛋白，抑制細菌細胞壁的合成[14]。當細菌產(chǎn)生 β-內(nèi)酰胺酶后，可使 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物水解失活。β-內(nèi)酰胺酶分為 4 種類型，其中Ⅱ型酶是由質(zhì)粒介導(dǎo)的，包括TEM、OXA、CMY 等[7]。本研究β-內(nèi)酰胺類的耐藥基因中只測出blaTEM-1和DHA基因，陽性率均為23.8%（5/21），而blaCTX-M1、blaCTX-M2、blaCTX-M8、 blaCTX-M9、blaSHV、blaCMY-2和blaPSE-1基因在所有菌株中均未被檢測到，與國內(nèi)其他報道在耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物沙門菌株TEM攜帶率較高一致[5，13]。

氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥機制主要是氨基糖苷類鈍化酶的產(chǎn)生使氨基糖苷類抗菌藥物對菌株無法發(fā)揮作用，同一種抗菌藥物因藥物的分子結(jié)構(gòu)中可能存在多個結(jié)合位點又可被多種鈍化酶所鈍化，有報道指出傷寒沙門菌以AAC（3）Ⅱ為主[15]。本研究中，氨基糖苷類抗菌藥物耐藥株攜帶鈍化酶aadA1基因檢出率為25%（1/4），而且在敏感菌株中也有相當高的攜帶率，提示還有其他耐藥機制影響其耐藥表型，如抗菌藥物的作用靶位改變、細胞壁通透性改變或細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運異常等[15-16]。

喹諾酮類抗菌藥物耐藥機制主要是其作用于DNA解旋酶和拓撲異構(gòu)酶，其亞單位分別由gyrA、gyrB和parC、parE基因編碼[15]。沙門菌中g(shù)yrA基因是氟喹諾酮類藥物的最初靶位，位于gyrA蛋白第67和106位氨基酸殘基之間，喹諾酮耐藥決定區(qū)中經(jīng)常突變而引起對氟喹諾酮類藥物的抗性；parC基因是拓撲異構(gòu)酶Ⅳ編碼基因，也可能是喹諾酮類藥物的作用靶位，parC中第57位、第80位突變均可引起抗性產(chǎn)生[17]。 本研究結(jié)果表明沙門菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率較高，其基因攜帶率qyrA4為47.1%（8/17）、parC為58.8%（10/17）、qnrC為17.6%（3/17），qnrB為11.7%（2/17），而敏感菌株均未被測出，提示qyrA4、parC、qnrC和qnrB基因仍是喹諾酮類抗菌藥物的主要耐藥機制。

二氫蝶呤氨苯甲酸合成酶是細菌細胞生長所必需的葉酸生物合成途徑中的一部分，磺胺可與二氫蝶呤氨苯甲酸合成酶相互作用，從而阻止細菌葉酸的合成，抑制細菌的生長繁殖。細菌編碼二氫蝶酸合成酶的耐藥基因有sul Ⅰ、sulⅡ、sul Ⅲ3種[15]，本研究結(jié)果顯示，磺胺類耐藥菌株主要攜帶sul Ⅰ基因[66.7%（4/6）]，其次為sul Ⅲ基因[16.7%，（1/6）]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在18株對氨基糖苷類敏感的菌株中，有15株分別攜帶有aph（3'）-Ⅱ a基因[5.6%，（1/18）]、aadA1基因[22.2%，（4/18）]、aadB基因[5.6%，（1/18）]和strB基因[50.0%，（9/18）]。同時，在16株對磺胺類敏感的菌株中，有1株攜帶sul Ⅱ基因[6.25%，（1/16）]。以上結(jié)果提示這些耐藥相關(guān)基因可能不是獨立發(fā)揮耐藥作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示上海地區(qū)沙門菌的主要血清型為腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌，而且其耐藥狀況嚴重，耐藥機制復(fù)雜，很多機制還有待于深入研究。同時，不同地區(qū)耐藥情況也有所差異，提示臨床應(yīng)該根據(jù)藥物敏感性試驗結(jié)果進行精準的診斷和治療。