徐 敉,許春立

(1上海市滬東醫(yī)院內(nèi)科,上海 200129;2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:2059015451@qq.com)

腦卒中是全世界范圍內(nèi)的普遍高發(fā)的一類腦血管疾病,是造成人類死亡的主要疾病之一,發(fā)病年齡有年輕化的趨勢。腦卒中的病因復(fù)雜,治療困難,發(fā)病突然,是其主要的危害性所在[1]。血府逐瘀湯是以中藥成分治療腦卒中、頸動(dòng)脈硬化等疾病的常用復(fù)方藥[2],其治療腦卒中的作用機(jī)制尚未完全闡明。代謝組學(xué)在疾病病理機(jī)制與中藥復(fù)方及其療效機(jī)制研究中得到了廣泛的應(yīng)用[3]。目前,利用代謝組學(xué)技術(shù)研究血府逐瘀湯液對缺血性腦卒中保護(hù)作用的研究未見報(bào)道,本研究構(gòu)建大鼠腦缺血模型,通過代謝組學(xué)技術(shù)探究血府逐瘀湯對腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用的潛在的代謝干預(yù)機(jī)制,為血府逐瘀湯的臨床應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

色譜級甲醇和乙腈購于Oceanpak公司(瑞典)。色譜柱:UPLC HSS C18色譜柱(型號:100×21×17)購于美國Waters公司。Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀G2-X2 QTOF四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀購于美國Waters公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與分組

30只雄性SD大鼠(8周齡,體質(zhì)量180-220 g,清潔級)及飼養(yǎng)飼料購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2017-0005。購回后常規(guī)飼養(yǎng),室溫22-24 ℃。10只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和中藥治療組,每組10只,給予飼料和飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d開始給藥和造模,給藥時(shí)間點(diǎn)為造模前48 h,24 h,2 h和造模后24 h,48 h和72 h。血府逐瘀湯由當(dāng)歸9 g,生地黃9 g,紅花9 g,赤芍6 g,柴胡3 g,枳殼6 g,桔梗4.5 g,桃仁12 g,牛膝9 g,川芎4.5 g,甘草6 g組成。經(jīng)水煎后過濾濃縮成濃度為2 g/L,中藥治療組灌胃血府逐瘀湯劑量為10 g/kg。假手術(shù)組和模型組在相同時(shí)間點(diǎn)灌胃等劑量的生理鹽水。造模后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分,造模48 h,所有大鼠均摘眼球取血,制備血清,用于質(zhì)譜檢測血清代謝譜。

1.3 大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型的建立

MCAO模型是常用的缺血性腦卒中動(dòng)物模型。造模方法參考文獻(xiàn)[4],具體操作步驟如下:10%水合氯醛麻醉,隨后頸部備皮,消毒鋪巾,頸部正中切一開口,暴露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)外動(dòng)脈,距離頸總動(dòng)脈分叉4 mm處結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端,在頸外動(dòng)脈穿入另一根6-0絲線,在靠近頸總動(dòng)脈分叉處打活結(jié),動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈,并在距離頸總動(dòng)脈分叉處3 mm處的頸外動(dòng)脈上剪開一小口,將一根頭端處理過的0.33 mm直徑的尼龍線從小口中插入,進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈,并向內(nèi)插入大腦中動(dòng)脈,尼龍線的插入深度距離頸總動(dòng)脈分叉處約16 mm,缺血后90 min拔掉線栓,縫合頸部傷口。假手術(shù)組不插入線栓,其他操作同模型組。造模后24 h對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

1.4 神經(jīng)功能評分

神經(jīng)功能評分參考Longa及Bederson的5分法:0分,無神經(jīng)損傷癥狀;1分,對側(cè)前爪不能完全伸展;2分,向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分,向?qū)?cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識喪失。分值越高,說明動(dòng)物神經(jīng)行為障礙越嚴(yán)重[5]。

1.5 代謝組學(xué)檢測代謝產(chǎn)物

血液代謝物提取:準(zhǔn)確稱取200 μl血液樣品,加入甲醇400 μl,旋渦30 s混勻,12 000 r/min,4 ℃離心10 min。取上清液,用氮?dú)獯蹈?加入200 ml甲醇水(w/w為1 ∶1)超聲溶解,0.22 μm濾膜過濾,待上樣;進(jìn)樣量:2 μl;色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C8(10 cm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:A相為0.1%甲酸,B相為乙腈;梯度洗脫0-30 min,10%-90% B液,流速300 μl/min;質(zhì)譜條件:離子源電壓4.5 kV,毛細(xì)管電壓49 V,毛細(xì)管溫度325 ℃,采集正離子模式數(shù)據(jù),掃描范圍100-800 m/z。

1.6 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入XCMS軟件進(jìn)行保留時(shí)間校正、峰積分等,和數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配和校正(參數(shù):FWHM=10,BW=10,snthersh=5,其他默認(rèn)值)。80%以上樣品所含峰為共有峰進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾。定性后的數(shù)據(jù)分析采用SMICA 14.1、Kegg和MetaboAnalyst等軟件或在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。首先,采用峰面積法對所有峰進(jìn)行面積歸一化(單個(gè)峰面積/總面積),將整理好的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SMICA軟件中進(jìn)行單變量分析和多變量分析,分析方法參考文獻(xiàn)[6],單變量分析采用Student’sttest,多元變量統(tǒng)計(jì)分析采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA),分別繪制兩種模型二維的主成分得分平面圖,對于OPLS-DA分析進(jìn)行置換檢驗(yàn),檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠翊嬖谶^擬合,并計(jì)算差異貢獻(xiàn)變量指標(biāo)VIP值。進(jìn)一步篩選同時(shí)滿足單變量分析中P<0.05和OPLS-DA分析中VIP>0.05的化合物作為代謝標(biāo)志物。將篩選到的代謝物整理并導(dǎo)入MetaboAnalyst網(wǎng)站進(jìn)行代謝通路拓?fù)浞治龊透患治觥?/p>

2 結(jié)果

2.1 血府逐瘀湯液對CIS大鼠保護(hù)作用及代謝標(biāo)志物

血府逐瘀湯液干預(yù)CIS大鼠后神經(jīng)功能損傷情況有顯著緩解,模型組神經(jīng)功能評分顯著高于假手術(shù)組和給藥組(見圖1)。通過所有樣本在PCA模型的主成分得分散點(diǎn)圖可以看出,三組樣本之間均有較為明顯的區(qū)分,其中給藥組與假手術(shù)組的分布更為接近,且與模型組有明顯的區(qū)分(見圖2A),揭示血府逐瘀湯液對CIS大鼠癥狀可能有改善作用。通過OPLS-DA分析得到每兩組之間的預(yù)測主成分(t[1])和正交主成分(to[1])的得分散點(diǎn)圖(見圖2B-D),三個(gè)模型對給藥組和假手術(shù)組、給藥組和模型組、模型組和假手術(shù)組之間的差異有顯著的區(qū)分能力,且三個(gè)模型的R2Y和Q2分別為0.998和0.525,0.986和0.612,0.991和0.627。結(jié)合置換檢驗(yàn)得到的結(jié)果均證明模型具有較好的預(yù)測能力,沒有出現(xiàn)過擬合的情況。確認(rèn)模型可靠后,通過軟件計(jì)算得出,每個(gè)OPLS-DA模型中所有代謝物(變量)對組間區(qū)分的變量投影重要度(VIP)值,根據(jù)VIP大于1和T檢驗(yàn)得到的P<0.05篩選代謝標(biāo)志物,代謝標(biāo)志物信息見表1。從表1中可以看出,模型組和假手術(shù)組之間篩選出16個(gè)差異代謝物,其中顯著上調(diào)的代謝物有12個(gè),下調(diào)的有4個(gè),給藥組與模型組相比,篩選出14個(gè)差異代謝物,其中顯著上調(diào)的有4個(gè)代謝物,下調(diào)的有10個(gè)代謝物。模型組上調(diào)的12個(gè)代謝物中,給藥組有7下調(diào),模型組下調(diào)的4個(gè)代謝物中,給藥組有3個(gè)下調(diào)。說明血府逐瘀湯液對CIS大鼠的保護(hù)作用與多個(gè)代謝物參與的代謝途徑有關(guān)。

與假手術(shù)組相比,**P<0.01

表1 血府逐瘀湯液對CIS大鼠保護(hù)作用的潛在內(nèi)源性代謝標(biāo)志物Table 1 Metabolites in protective effect of Xuefu Zhuyu decoction against CIS in rats

2.2 血府逐瘀湯液對CIS大鼠保護(hù)作用的代謝通路分析

進(jìn)一步對篩選到的給藥組與模型組之間的差異代謝物,導(dǎo)入MetaboAnalyst 4.0 進(jìn)行代謝通路拓?fù)浞治龊透患治?結(jié)果見圖3,圖中縱坐標(biāo)表示富集分析的P值,橫坐標(biāo)表示拓?fù)浞治龅腎mpact值。由圖3可以看出,血府逐瘀湯對CIS保護(hù)作用的代謝途徑主要有氨基酸代謝(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,精氨酸和脯氨酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和色氨酸代謝)、鞘磷脂代謝和丁酸代謝等。以上代謝途徑可能是血府逐瘀湯對CIS大鼠腦神經(jīng)保護(hù)作用的代謝機(jī)制。

3 討論

腦血管疾病是一類由血管病變、血液成分變化和血液動(dòng)力學(xué)改變引起的出血性或缺血性腦病。腦缺血發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,并通過多種代謝途徑產(chǎn)生腦神經(jīng)損傷,包括能量代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、神經(jīng)遞質(zhì)等多種代謝途徑紊亂[7,8]。傳統(tǒng)中藥對腦缺血有較好的治療和神經(jīng)保護(hù)作用,常用于腦卒中患者的治療。近年來,基于質(zhì)譜技術(shù)的大量代謝組學(xué)研究表明,多種傳統(tǒng)中藥復(fù)方對缺血性腦卒中的保護(hù)和治療作用與多種代謝途徑的調(diào)節(jié)有關(guān),如氨基酸代謝、能量代謝和脂質(zhì)代謝等[9-12]。血府逐瘀湯為最早源自清代的活血化淤的經(jīng)典方,常用于淤血病證的治療,對腦卒中也有較為顯著的療效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明,淤血是缺血性腦卒中的最常見發(fā)病機(jī)制,淤血阻滯,造成血流動(dòng)力學(xué)改變,腦髓失養(yǎng),重者造成半身不遂、言蹇舌強(qiáng)和麻木不仁等癥狀。因此對缺血性腦卒中的治療,可以采用活血化瘀法,促進(jìn)血液流動(dòng),進(jìn)而減輕腦缺血產(chǎn)生的神經(jīng)損傷?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,血府逐瘀湯具有擴(kuò)張血管、促進(jìn)血液流動(dòng)、抗血栓、抗動(dòng)脈硬化等作用。此方中桃仁、紅花、川芎、當(dāng)歸、生地黃、當(dāng)歸和赤芍乃為活血祛淤良藥,柴胡、枳殼則理氣,牛膝有引血下行、活血通經(jīng)之功效,桔梗載藥上行,諸藥配伍,可達(dá)到活血化淤和理氣通絡(luò)之功效[13,14]。本研究結(jié)果顯示血府逐瘀湯對CIS治療作用的代謝途徑主要有氨基酸代謝(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,精氨酸和脯氨酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和色氨酸代謝)、鞘磷脂代謝和丁酸代謝等。

本研究通過線栓法構(gòu)建缺血性腦卒中大鼠模型,通過代謝組學(xué)技術(shù)檢測代謝物在血府逐瘀湯對缺血性腦卒中大鼠治療作用的變化。結(jié)果在模型組和假手術(shù)組之間篩選出16個(gè)差異代謝物,其中12個(gè)顯著上調(diào),4個(gè)顯著下調(diào);治療組與模型組對比,篩選出14個(gè)差異代謝物,其中4個(gè)顯著上調(diào),10個(gè)顯著下調(diào)。模型組上調(diào)的12個(gè)代謝物中,在給藥組中有7下調(diào),模型組下調(diào)的4個(gè)代謝物中,治療組有3個(gè)下調(diào)。從代謝水平揭示血府逐瘀湯對缺血性腦卒中具有治療作用,能部分逆轉(zhuǎn)或保護(hù)腦缺血產(chǎn)生的神經(jīng)損傷。通過進(jìn)一步的代謝通路分析發(fā)現(xiàn),血府逐瘀湯對大鼠的多種氨基酸代謝、鞘磷脂代謝和丁酸代謝有調(diào)控作用[15]。研究表明,大鼠腦缺血后谷氨酸-谷氨酰胺代謝、天冬氨酸-肌酸代謝等氨基酸代謝紊亂,說明腦缺血導(dǎo)致了腦組織神經(jīng)元細(xì)胞的損傷[16],本研究的結(jié)果表明谷氨酸和天冬氨酸代謝的異常,同時(shí)還提示精氨酸和脯氨酸代謝異常,甘氨酸、絲氨酸和色氨酸代謝紊亂。鞘磷脂代謝參與多種生理過程,如細(xì)胞分化、增殖、分化、神經(jīng)調(diào)節(jié)、炎癥信號等。研究發(fā)現(xiàn),腦缺血患者二氫神經(jīng)鞘氨醇和植物鞘氨醇上調(diào)引起鞘磷脂代謝異常,可能誘導(dǎo)細(xì)胞壞死、凋亡和炎癥,從而引發(fā)腦卒中[17]。丁酸是體內(nèi)存在的一種與多種生理病理過程有關(guān)的小分子短鏈脂肪酸[18],本研究發(fā)現(xiàn),CIS大鼠丁酸代謝異常,可能與γ-氨基丁酸(GABA)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能有關(guān)。

綜上所述,血府逐瘀湯對缺血性腦卒中大鼠有顯著治療作用,并可能與調(diào)節(jié)氨基酸代謝、鞘脂類代謝和丁酸代謝有關(guān)。