陳 輝

（華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬遺傳育種重點開放實驗室，湖北 武漢 430070）

豬的人工授精（AI）技術是一種優(yōu)良的種豬繁育技術，AI 可以改善種豬的繁育利用率、促進豬群遺傳改良的進展以及不同場間的基因交流。該技術為全世界大多數(shù)集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)企業(yè)所采用，隨著我國規(guī)模化養(yǎng)豬進程的加快，AI 技術在我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大的作用[1]。隨著養(yǎng)豬規(guī)模進一步擴大，養(yǎng)殖生產(chǎn)廠家對優(yōu)質(zhì)公豬精液的需求量日益增加，AI 技術使用的效果在很大程度上取決于公豬精液品質(zhì)的好壞，因而改善優(yōu)秀種公豬精液保存的效果對AI 技術的廣泛推廣應用具有積極意義。文章從影響種公豬精液保存效果的因素作了較為系統(tǒng)的闡述，從抗凍劑[2]、抗氧化劑[3]、抗菌肽[4]、稀釋液配方及方法[5]等方面闡述了對種公豬精液保存效果的影響，并簡要地分析了種公豬精液品質(zhì)的評價體系。筆者結合國內(nèi)外的相關研究，就影響種公豬精液保存效果的因素分析加以綜述，闡明各因素對種公豬精液保存效果的影響，旨在為種豬繁育研究人員、公豬站以及種豬生產(chǎn)企業(yè)一線人員提供思路和科學依據(jù)，促進場間的遺傳交流，進一步改善我國整體養(yǎng)豬生產(chǎn)水平以及地方畜禽資源的保種情況，打造出中國種豬種業(yè)航母。

1 種公豬精液品質(zhì)保存效果的評價指標

在現(xiàn)代規(guī)模化養(yǎng)豬生產(chǎn)中，種公豬精液品質(zhì)對養(yǎng)豬生產(chǎn)的效益具有很大影響。我國豬精液品質(zhì)評價標準（GB/T 25172-2010）要求檢測公豬精液的外觀（要求顏色呈乳白色，無雜質(zhì)）、精子密度（要求高于1 億/mL）精子活力（要求高于0.6）、每劑量直線前進的精子數(shù)（要求高于25 億）、精液pH（精液呈弱堿性，要求pH 在7.0 ～7.8 之間）、頂體完整率（要求高于51%為合格）以及畸形率（要求低于20%）等指標來衡量精液保存的效果[6]。除此以外，部分企業(yè)和種公豬站也會對精子的活動能力、精液中相關酶（抗氧化性酶）、冷休克指標以及微生物等指標進行測定，從而對精液品質(zhì)進行全面評定，但目前這些企業(yè)要求尚無具體標準。

2 影響種公豬精液保存效果的因素

2.1 抗凍劑

冷凍保存法是長期保存種豬精液的有效措施，豬精液對低溫敏感，在冷凍過程會使豬精液發(fā)生“冷休克”現(xiàn)象，從而降低其使用價值，因而大量的學者針對這一現(xiàn)象開發(fā)了多種抗凍劑。Fang 等[2]在大白豬精液緩沖液中添加了40%的異源精漿（SP），觀察其對凍融精液品質(zhì)的影響，與對照組比（未添加SP），SP 組精液的活力和精子穿透力顯著增加（P ＜0.05），降低了精子低溫獲能和酪氨酸磷酸化（P ＜0.05），同時觀察到AI 母豬的妊娠率顯著增加了42.64%（P＜0.05）。Trzcinska 等[7]發(fā)現(xiàn)在雜交豬（波蘭長白×大白豬）精液冷凍保存液中添加1.0 mM 丁基化羥基甲苯（BHT）可以改善豬精液冷凍保存效果，該研究觀察到使用添加BHT 的冷凍精液進行AI 可以顯著降低精液的脂質(zhì)過氧化（P ＜0.001），顯著增加精子的運動能力、膜完整性以及頂體完整性（P＜0.001），表明添加1.0 mMBHT有利于精液冷凍保存以及提高精子的受精能力。有研究發(fā)現(xiàn)，在精液冷凍保存液中添加鴕鳥蛋黃（LPFO）可提高凍融后精子的活力，提高有效精子數(shù)[8]。有研究表明，在豬精液冷凍培養(yǎng)液中添加2 mM 還原型谷胱甘肽（GSH）以探索其對精液冷凍保存和凍融精子品質(zhì)的影響，結果表明，使用添加GSH 后的精液顯著提高了分娩率、總產(chǎn)仔數(shù)以及產(chǎn)活仔數(shù)（P ＜0.05），表明GSH 對冷凍保存精液的品質(zhì)具有很好的改善作用[9]。Athurupana 等[10]研究了海藻糖替代部分甘油對精液冷凍保存效果的影響，使用100 mM 海藻糖替代冷凍劑甘油，結果發(fā)現(xiàn)對解凍后精子的活力無顯著變化，但替代后顯著改善了解凍精子的活動性、顯著增加了線粒體膜電位（MMP），表明用海藻糖替代部分甘油是可行的，對精液冷凍保存效果具有改善作用。

2.2 抗氧化劑

精子在冷凍保存過程中容易被氧化，導致受精能力降低乃至喪失，因而開發(fā)一種抗氧化劑對精液冷凍保存效果的改善具有重要意義，大量研究表明黃芪多糖（APS）、芹菜素（AP）和阿魏酸（FA）對精液冷凍保存的抗氧化效果具有改善作用。Weng 等[11]評估了黃芪多糖（APS）對低溫保存精子抗氧化性的影響，在保存液中添加了0.5 mg/mL APS，解凍后37 ℃孵育1 h 后，APS 組與對照組（未添加抗氧化劑）相比，超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性顯著增加、活性氧（ROS）濃度顯著降低（P ＜0.05），同時APS 組精液的受精率得到了改善、卵裂率和胚泡率顯著增加（P ＜0.05），表明APS 可通過改善冷凍精液的抗氧化性來改善精液的繁殖能力。芹菜素（AP）和阿魏酸（FA）是一種良好的抗氧化劑，對冷凍保存精液具有很好的改善作用，已有研究證實，在冷凍保存液中添加0.1 mmol / L AP 加0.15 mmol / L FA可增加凍融精液抗氧化酶活性，改善了凍融精液的運動性、質(zhì)膜完整性、頂體完整性以及線粒體活性[12]，表明兩者聯(lián)合使用具有很好的改善作用。研究證實，在冷凍稀釋液中添加0.2 g/L 芝麻酚能顯著提高解凍后豬精子活率（P ＜0.05）、改善功能完整性和抗氧化能力（P ＜0.05）[13]。

常溫保存（17 ℃條件下儲存）也是精液液體保存的一種主要方法，為防止液體精液在保存期間發(fā)生氧化應激，Wang 等[14]首次在精液BTS 保存液中添加了不同劑量（0、10、20、40 和80 mM）的L-谷氨酰胺（L-Glu），以探索L-Glu 對常溫保存精液抗氧化性的影響，結果表明，添加L-Glu 后會顯著降低活性氧濃度（ROS）、同時顯著增強了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）活性和精子中谷胱甘肽（GSH）的含量；此外研究還發(fā)現(xiàn)添加20 mM Gln 時對精子的運動性、頂體完整性以及質(zhì)膜完整性具有顯著的改善作用（P ＜0.05）。胡亞美等[15]研究結果表明，在BTS 精液稀釋液中添加50 μg/mL 原花青素（OPC）可改善藏豬精液的抗氧化性能、精子活率以及頂體完整率（P ＜0.05）。相似的研究發(fā)現(xiàn)，常溫精液稀釋液中添加0.5 μmol/L 的抗氧化劑蝦青素對17 ℃下保存精液的活力和運動性得到改善，研究認為蝦青素對豬精液常溫保存具有改善作用[16]。綜上表明，稀釋液中添加適宜的抗氧化劑對精液的冷凍保存或常溫保存效果具有改善作用。

2.3 抗菌肽

精液在保存過程中容易滋生細菌微生物，從而對精液的保存效果產(chǎn)生不利影響。抗菌肽（AMP）是一種氨基酸多肽，具有廣譜殺菌活性和低耐藥性，被開發(fā)應用于精液保存過程中。相關研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加抗菌肽（AMP）有助于抵御微生物侵襲，進而改善精液保存效果。Puig-Timonet 等[4]評估了豬β 防御素-1（PBD1）和豬β 防御素-2（PBD2）是否有替代抗生素的可能，在17 ℃保存精液的稀釋液中，保存10 d 后使用瓊脂評估了3 種不同濃度AMP 對微生物的抑制作用，結果發(fā)現(xiàn)當AMP 的添加量為3 μM時具有顯著的抑菌作用，但不會對精子活力產(chǎn)生顯著影響，研究表明PBD-1 和PBD-2 可替代抗生素添加到保存液中。Sancho 等[17]在17 ℃保存的稀釋液中添加了（2.5，25 和100 μg/ mL）的微生物肽（PG1），以評估其抑菌能力，平板試驗表明細菌數(shù)隨PG1 濃度增加而顯著降低（P ＜0.05），但精子存活率與PG1的濃度增加而顯著降低（P ＜0.05），因而需要合理選擇AMP 的濃度方能平衡抑菌和保持精液品質(zhì)。而據(jù)Bussalleu 等[18]報道，稀釋液中添加3 μM 豬骨髓抗菌肽37（PMAP-37）可以有效地抑制細菌生長，同時可以很好地保存精子活力，研究認為PMAP-37 是一種潛在抗生素替代物。除此以外，也有研究報道，陽離子微生物肽也是潛在的抗生素替代物，研究發(fā)現(xiàn)添加低濃度環(huán)狀六肽（4 μMc-WFW，2 μMc-WWW）時的精子各項指標與對照組無顯著差異，同時發(fā)現(xiàn)可以有效地促進精子進行直線運動[19]。綜上說明抗菌肽在精液保存中起著重要作用，在生產(chǎn)中應合理選擇抗菌肽種類和濃度。

2.4 稀釋配方及稀釋方法

大量研究表明不同的稀釋液以及稀釋方法會對種公豬精液保存的效果產(chǎn)生很大的影響。在不同稀釋液對精液保存效果的影響方面，Dziekonska 等[20]研究了3 種不同商業(yè)稀釋液（BTS、Androhep（AH）、Gedil（GD））對精子預冷和凍融后的影響，結果表明，AH 稀釋液組精子質(zhì)膜完整性和ATP 含量顯著高于BTS 和GD 組（P ＜0.05），且谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性顯著高于BTS 稀釋液，綜合來看，使用AH 稀釋液有助于解凍后精子品質(zhì)的改善。賈玉川等[21]研究結果表明，使用美國某精液稀釋液后的精子活力好、活力高以及存活時間長，表明其保存效果優(yōu)于日本、西班牙以及國產(chǎn)精液稀釋液。譚曉山等[22]研究發(fā)現(xiàn)自行研制稀釋液配方4 適用于杜洛克豬，而配方2 適用于大白豬（具體配方請見參考文獻）。

不同的稀釋方法對精液保存的效果也會產(chǎn)生影響，Schulze 等[23]比較了一步等溫稀釋、兩步稀釋以及三步稀釋法對精液品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)一步法稀釋后的精子的耐熱性顯著高于兩步法和三步法（P ＜0.05），同時一步法省時省力，降低了稀釋錯誤，研究認為在實際生產(chǎn)中選擇一步稀釋法為好。有研究指出，不同的稀釋順序（對照：將稀釋劑加入至精液中；反向：將精液加入稀釋液中）會對精子分布產(chǎn)生顯著影響（P ＝0.029）[24]。何經(jīng)緯等[25]發(fā)現(xiàn)使用精確稀釋法生產(chǎn)的常溫精液瓶數(shù)顯著高于使用傳統(tǒng)稀釋法生產(chǎn)的常溫精液量（P ＜0.05）。綜上表明，不同的稀釋液以及稀釋方法對精液保存效果具有很大影響，在實際生產(chǎn)中，應根據(jù)實際情況合理選擇稀釋配方及稀釋方法。

2.5 其他因素

除了上述因素對會對精液保存效果產(chǎn)生影響外，保存液的pH、季節(jié)以及溫度等因素均會對精液保存效果產(chǎn)生影響。研究表明，保持冷凍稀釋液的pH 為8（弱堿性）的條件下能夠有效改善解凍后精子的質(zhì)量[26]。也有研究發(fā)現(xiàn)，溫合保存液的pH 有利于精液的常溫保存[27]。Fraser 等[28]研究表明秋冬季節(jié)時公豬的精子完整性、頂體完整率以及滲透壓耐受性顯著高于春夏季節(jié)（P ＜0.05），表明季節(jié)因素也是影響精液保存的一個重要因素。在溫度因素方面，有研究發(fā)現(xiàn)36 h 17 ℃和25 ℃下活精子數(shù)顯著高于8 ℃下保存的精子數(shù)（P ＜0.05）；在超低溫冷凍后豬豬精子活力、質(zhì)膜完整率、線粒體活性和頂體完整率顯著低于新鮮精液（P ＜0.05）[29-30]。

3 小結與展望

縱觀全文，影響豬精液保存的因素主要有抗凍劑、抗氧化劑、抗菌肽、稀釋配方以及稀釋方法等因素。除此以外，pH、季節(jié)以及溫度也是重要的影響因素；在實際生產(chǎn)中，通過在保存液添加抗凍劑、抗氧化劑以及抗菌肽，同時選擇合理的稀釋配方和稀釋方法，可以有效地改善精液保存效果，從而使精液在AI 中發(fā)揮更大的作用。但是還有諸多因素會影響豬精液的保存效果，如pH 對精液保存效果的相關研究鮮有報道、不同抗凍劑、抗氧化劑等相互配伍的相關研究較少，今后可加大相關研究的力度；同時精液相關評定標準還尚需完善（如可全面測定精子抗氧化性指標、冷休克指標等）。相信隨著分子生物技術的發(fā)展以及國家AI 技術的大力推廣和使用，相關研究將會得到開展、標準將會更加完善，有效地解決上述問題，從而進一步改善豬精液保存的效果，發(fā)揮AI 技術的優(yōu)勢，使優(yōu)良公豬的繁殖性能得到更好的發(fā)揮，強化場間的遺傳交流，從整體生產(chǎn)上改善我國的生豬養(yǎng)殖水平。