范成凱 應(yīng)南嬌 樊 凱 徐 瑩 楊 勇

(杭州電子科技大學(xué)生命信息與儀器工程學(xué)院，浙江杭州 310018)

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是人類生產(chǎn)生活中最重要的微生物菌種之一，被廣泛應(yīng)用于酒品釀造、食品烘焙及生物質(zhì)乙醇等化合物的生產(chǎn)，在整個發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要的催化作用[1-2]。為了滿足巨大的應(yīng)用需求，人們嘗試采用各種方法來提高釀酒酵母的發(fā)酵能力，以縮短發(fā)酵時間，提高糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇等產(chǎn)物的效率，進(jìn)而降低生產(chǎn)時間和成本、增加生產(chǎn)效益。近年來，各種新興的物理輔助技術(shù)應(yīng)用于微生物發(fā)酵的潛能越來越受到人們關(guān)注。研究表明，靜態(tài)磁場對釀酒酵母的生長具有促進(jìn)作用[3-4]，低功率超聲波也可以提高釀酒酵母發(fā)酵過程中乙醇的產(chǎn)出[5-6]。

高壓脈沖電場(pulsed electric field，PEF)作為一種非熱滅菌技術(shù)，因其處理效率高、能耗需求低及對環(huán)境無污染等良好的應(yīng)用特性主要被用于液態(tài)食品滅菌領(lǐng)域[7-9]，有關(guān)PEF對微生物滅菌的機(jī)理機(jī)制也有諸多研究。隨著對PEF技術(shù)的深入了解，PEF的應(yīng)用價值被進(jìn)一步挖掘且不再局限于微生物滅菌領(lǐng)域。研究表明，PEF作用下植物細(xì)胞中花青素等次級代謝產(chǎn)物的合成增加[10-11]，Ohshima等[12]研究發(fā)現(xiàn)在電場強(qiáng)度為12 kV·cm-1的 PEF處理60 s后，大腸桿菌中的β-半乳糖苷酶的活性得到提高；Yin等[13]研究發(fā)現(xiàn)PEF可以提高厭氧氨氧化菌的活性并促進(jìn)其生長，且與低強(qiáng)度超聲波和磁場相比，PEF表現(xiàn)出更高的處理效率。釀酒酵母的發(fā)酵建立在細(xì)胞內(nèi)一系列的酶催化反應(yīng)及良好的生長代謝的基礎(chǔ)上。前人研究表明，適當(dāng)條件下的PEF可以提高酶的活性并促進(jìn)細(xì)胞的生長，這為PEF作為一種更具優(yōu)勢的方法應(yīng)用于酵母發(fā)酵提供了可能性[13]。

目前，有關(guān)PEF對釀酒酵母生理行為影響的研究主要集中在食品加工領(lǐng)域中對酵母菌的滅活等方面，而PEF對釀酒酵母發(fā)酵能力的影響尚鮮見報道。為了尋求PEF技術(shù)應(yīng)用于釀酒酵母發(fā)酵的可行性，本研究以電場強(qiáng)度為唯一變量，采用不同電場強(qiáng)度的PEF刺激釀酒酵母，通過檢測發(fā)酵底物中酵母生長量、葡萄糖消耗量和乙醇產(chǎn)出量等指標(biāo)，并利用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometer，F(xiàn)CM)檢測釀酒酵母細(xì)胞生理狀態(tài)的變化，綜合分析PEF對釀酒酵母生理狀態(tài)和發(fā)酵能力的影響，以期為PEF技術(shù)應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 酵母菌懸浮液的制備

活性干酵母粉(版號HY1505)購自湖北宜昌安琪酵母公司；酵母液態(tài)培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium，YPD):葡萄糖 20 g·L-1、蛋白胨 20 g·L-1、酵母提取物 10 g·L-1；YPD 瓊脂固體培養(yǎng)基另加 20 g·L-1瓊脂粉。

酵母活化:在100 mL濃度為4%的葡萄糖溶液中加入2 g活性干酵母粉，輕輕混勻后35℃靜置15 min，取適量劃線至YPD瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到單菌落后接種至YPD液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)(30℃，180 r·min-1)至對數(shù)生長期備用。

1.2 高壓脈沖電場預(yù)處理

高壓脈沖電場處理系統(tǒng)由杭州電子科技大學(xué)研制開發(fā)[14]。選定高壓脈沖電場脈寬5 μs，頻率100 Hz、作用時間100 s、極板間距(d)1 cm、樣品處理容量1 mL，輸出波形為方波。場強(qiáng)E的計算公式為E=U/d，通過改變電壓來改變電場強(qiáng)度。本試驗采用PEF電場強(qiáng)度為1、6 kV·cm-1對釀酒酵母進(jìn)行預(yù)處理。

1.3 釀酒酵母熒光染色及流式分析

采用碘化丙啶(propidium iodide，PI)和羧基熒光素雙乙酸酯[5(6)-carboxyfluorescein diacetate，5(6)-cFDA]對釀酒細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測并表征酵母細(xì)胞內(nèi)酯酶活性和酵母細(xì)胞生理狀態(tài)[15]。

釀酒酵母懸浮液經(jīng)PEF處理后用PBS緩沖液(pH 值 7.2)清洗并離心(4 000 r·min-1，4℃，3 min)2次，然后用PBS緩沖液將酵母細(xì)胞重懸至濃度為105～106CFU·mL-1。取1 mL釀酒酵母菌懸液，加入10 μL 2 mg·mL-1PI染液，30℃避光孵育 10 min，然后加入 10 μL 5 mg·mL-15(6)-cFDA 染液，再次 30℃避光孵育10 min，染色完成后用PBS緩沖液清洗2次并重懸至1 mL。以相同體積不進(jìn)行任何染色的酵母懸浮液作為陰性對照。采用 Accuri C6流式分析儀(美國BD公司)對酵母細(xì)胞進(jìn)行分析，每個樣品收集約10 000個細(xì)胞。

1.4 酵母發(fā)酵培養(yǎng)

酵母發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖70 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、硫酸銨 1 g·L-1、磷酸二氫銨 1 g·L-1、硫酸鎂1 g·L-1。PEF處理后的酵母懸浮液按5%接種量分別轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃恒溫?fù)u床(180 r·min-1)培養(yǎng)12 h，分別取發(fā)酵時間為4、8、12 h時的發(fā)酵底液，經(jīng)離心后取上清液，于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 釀酒酵母發(fā)酵活性的檢測

1.5.1 發(fā)酵底液中葡萄糖、酒精含量的測定 采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測定釀酒酵母發(fā)酵底液中的葡萄糖和酒精含量[16]。色譜分析條件:Shimadzu LC-10AD液相色譜儀(日本島津)，Shimadzu RID-10A示差檢測器(日本島津)，Shodex sugar KS-803配位交換色譜柱(日本Shodex)；流動相為 H2SO4-H2O 溶液(v/v，0.5 ∶1 000)，流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量0.5 mL，色譜柱柱溫為60℃。

1.5.2 發(fā)酵底液中釀酒酵母細(xì)胞生長量的測定 先取干燥離心管稱重，然后加入適量釀酒酵母發(fā)酵底液，4℃條件下10 000 r·min-1離心5 min，取沉淀用蒸餾水反復(fù)清洗并重復(fù)離心3次，棄去上清液后將裝有濕菌體的離心管置于65℃烘箱中干燥至恒重，減去離心管重量即得菌體干重。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 9.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEF處理對釀酒酵母生長量的影響

經(jīng)測定，發(fā)酵12 h后未經(jīng)PEF處理的釀酒酵母干重為 0.460±0.05 g，電場強(qiáng)度為 1、6 kV·cm-1的 PEF試驗組釀酒酵母發(fā)酵底物中酵母干重分別為0.512±0.006、0.419±0.027 g。 結(jié)果表明，經(jīng)在電場強(qiáng)度為1 kV·cm-1的PEF處理后釀酒酵母的生長得到提高，即1 kV·cm-1的PEF促進(jìn)了釀酒酵母細(xì)胞的生長。

2.2 釀酒酵母細(xì)胞的流式分析

PI染料表征破損及死亡生理狀態(tài)下的酵母細(xì)胞，cFDA染料表征細(xì)胞內(nèi)酯酶活性變化。LL區(qū)域表示細(xì)胞碎片或未得到PI和5(6)-cFDA染色的菌體，LR區(qū)域代表具有活性且細(xì)胞膜完整的酵母細(xì)胞，UR區(qū)域的細(xì)胞雖具有活性但是細(xì)胞膜受損，UL區(qū)域為已死亡細(xì)胞。PEF電場強(qiáng)度為1 kV·cm-1處理組中具有活性釀酒酵母細(xì)胞比例為89.8%，其中，具有細(xì)胞活性但細(xì)胞膜受損的比例為17.6%；6 kV·cm-1處理組中具有活性釀酒酵母細(xì)胞比例為89.9%，但細(xì)胞膜受損的活細(xì)胞比例為27.9%(圖1)。綜上，經(jīng)電場強(qiáng)度為1、6 kV·cm-1的PEF處理后，具有內(nèi)酯酶活性的釀酒酵母細(xì)胞比例均維持在較高水平，但PEF電場強(qiáng)度為6 kV·cm-1時，在具有活性的酵母細(xì)胞中細(xì)胞膜受損的比例大于1 kV·cm-1。

圖1 流式細(xì)胞儀分析染色釀酒酵母細(xì)胞結(jié)果Fig.1 Results of flow cytometry analysis of Saccharomyces cerevisiae

2.3 PEF處理對釀酒酵母發(fā)酵底物中葡萄糖及酒精含量的影響

葡萄糖是釀酒酵母生長代謝過程所需的重要營養(yǎng)物質(zhì)之一。乙醇是釀酒酵母發(fā)酵的主要產(chǎn)物。發(fā)酵底液中葡萄糖和乙醇含量的變化可以作為檢測釀酒酵母發(fā)酵能力的重要指標(biāo)。由圖2、圖3可知，發(fā)酵時間為0～8 h時，釀酒酵母的生長和發(fā)酵活動較為緩慢，發(fā)酵8 h后釀酒酵母發(fā)酵底物中的葡萄糖消耗的速度加快，同時乙醇產(chǎn)量也迅速增加，釀酒酵母的生長和代謝開始加速；發(fā)酵12 h時，與未經(jīng)PEF處理組(電場強(qiáng)度0 kV·cm-1)相比，電場強(qiáng)度1 kV·cm-1處理組釀酒酵母發(fā)酵底物中葡萄糖消耗量提高了10.18%，乙醇產(chǎn)出量提高11.05%，而6 kV·cm-1處理組組釀酒酵母發(fā)酵底液中葡萄糖消耗量和酒精產(chǎn)出量分別下降5.13%和9.06%。綜上，電場強(qiáng)度1 kV·cm-1的 PEF處理可提高釀酒酵母的葡萄糖消耗量和酒精含量。

3 討論

高壓脈沖電場處理會導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)“電穿孔”[17-18]，提高細(xì)胞膜的通透[19-20]，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞對離子、小分子物質(zhì)的吸收[21]。細(xì)胞增加營養(yǎng)物質(zhì)的攝取對其自身的生長及代謝具有重要意義。此外，高壓脈沖電場可以促進(jìn)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)[22]、提高酵母細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶的活性[23]。也有研究證實PEF處理后釀酒酵母細(xì)胞中谷胱甘肽合成酶相關(guān)的基因被誘導(dǎo)表達(dá)[24]；酶活性和相關(guān)基因表達(dá)量的增加也可能是釀酒酵母發(fā)酵能力提升的原因。高壓脈沖電場會對細(xì)胞膜造成一定的損傷，細(xì)胞膜受損的部分細(xì)胞在適當(dāng)條件下可恢復(fù)其原有活性[25-27]，但當(dāng)高壓脈沖電場強(qiáng)度足夠大時，細(xì)胞膜穿孔將進(jìn)一步擴(kuò)大，細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA等大分子內(nèi)容物外滲，甚至導(dǎo)致酵母細(xì)胞死亡[28-29]。因此，保證釀酒酵母的生存率是PEF提高釀酒酵母發(fā)酵能力的前提。

圖2 PEF處理對發(fā)酵底物中葡萄糖相對濃度的影響Fig.2 Effect of PEF treatment on relative glucose concentration of fermentation substrates

圖3 PEF處理對發(fā)酵底物中酒精含量的影響Fig.3 Effect of PEF treatment on ethanol concentration of fermentation substrates

本研究通過比較電場強(qiáng)度為1、6 kV·cm-1的PEF對釀酒酵母發(fā)酵能力的影響，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)條件下的PEF對釀酒酵母的發(fā)酵能力具有積極影響，可以加快酵母的生長繁殖，提高乙醇的產(chǎn)出效率。Mattar等[30]進(jìn)行的PEF刺激釀酒酵母生長的研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。此外，Najim等[31]研究發(fā)現(xiàn)PEF處理后保加利亞乳桿菌表現(xiàn)出對其生存環(huán)境更高的耐酸性，后續(xù)PEF對釀酒酵母影響的研究也可從釀酒酵母的耐酒精性等外界環(huán)境耐受性的角度進(jìn)行探究。綜合本研究中流式細(xì)胞術(shù)和發(fā)酵試驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，電場強(qiáng)度為1、6 kV·cm-1的PEF對釀酒酵母的細(xì)胞活性和發(fā)酵能力表現(xiàn)出不同的影響，經(jīng)1 kV·cm-1PEF刺激后的酵母細(xì)胞表現(xiàn)出更高的生長速率和發(fā)酵能力；而6 kV·cm-1組酵母細(xì)胞的生長與代謝活動卻低于對照組(電場強(qiáng)度0 kV·cm-1)，且對釀酒酵母的損傷效應(yīng)更為明顯。因此，選擇合適的電場參數(shù)對提高釀酒酵母發(fā)酵能力具有重要意義。在后續(xù)的研究中，可繼續(xù)深入探究不同電場參數(shù)與釀酒酵母發(fā)酵表現(xiàn)之間的關(guān)系，盡量減小PEF對酵母細(xì)胞造成的損傷，以達(dá)到提高釀酒酵母發(fā)酵能力的最佳效果。

4 結(jié)論

高壓脈沖電場處理可以促進(jìn)釀酒酵母細(xì)胞的生長和相關(guān)代謝活動從而提高釀酒酵母的發(fā)酵能力，經(jīng)電場強(qiáng)度為1 kV·cm-1的PEF處理后的釀酒酵母細(xì)胞，其菌體生長量、發(fā)酵底物中葡萄糖消耗量和酒精產(chǎn)出量均得到提升，表明選擇合適的高壓脈沖電場參數(shù)對釀酒酵母進(jìn)行預(yù)處理，可以促進(jìn)其發(fā)酵能力。本研究僅就PEF處理對釀酒酵母發(fā)酵能力的影響作了初步探討，今后可從釀酒酵母相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化的角度，深入研究PEF處理提高釀酒酵母發(fā)酵能力的作用機(jī)制。