王 剛， 胡俊強， 史建榮， 徐劍宏

[江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(南京)/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇南京 210014]

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，簡稱DON)又稱嘔吐毒素，是一種危害巨大的真菌毒素，主要由鐮刀菌產(chǎn)生，常見于受赤霉病侵害的谷物籽粒中。針對DON的毒理學(xué)研究表明，DON可以阻滯細(xì)胞周期并引發(fā)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對哺乳動物的腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒害，阻礙腸道上皮細(xì)胞增殖與分化，同時DON也會引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)，造成嘔吐、腹瀉等病癥[1]。相關(guān)研究表明，DON還具有血液毒性、骨髓毒性以及致癌性[2-3]，因此DON毒素對于食品安全存在重大威脅。根據(jù)最新的GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》，我國對谷物及其制品中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為 1 000 μg/kg。

江蘇省近年來谷物中DON毒素污染情況嚴(yán)重，根據(jù)筆者調(diào)研結(jié)果，2015、2016年江蘇省小麥中DON毒素平均含量分別為(2 087±112) μg/kg、(2 601±126) μg/kg，其平均含量已超過限量標(biāo)準(zhǔn)2倍，超標(biāo)率均在70%以上[4]。由于DON毒素污染，農(nóng)戶近年來蒙受了重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，DON的脫毒處理手段對于保障谷物食品安全、維護(hù)農(nóng)戶經(jīng)濟(jì)利益具有重大意義。

針對DON毒素的毒理學(xué)研究與脫毒研究需要大量DON純品，但目前DON純品價格極高，嚴(yán)重限制了相關(guān)研究的開展。由于DON毒素立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，手性中心眾多，因此針對DON的全合成工藝至今仍未開發(fā)成功。國內(nèi)外均有關(guān)于從鐮刀菌發(fā)酵物中提取并分離DON毒素的報道，其分離手段包括硅膠柱色譜、制備型液相以及高速逆流色譜等，其產(chǎn)量最高達(dá)每批次100 mg左右[5-8]。

大孔吸附樹脂是一類內(nèi)部具有孔洞結(jié)構(gòu)的交聯(lián)高分子材料，由于其具有高吸附容量以及可再生的優(yōu)點，因此被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化中，其純化原材料來源包括細(xì)菌發(fā)酵液[9]、真菌發(fā)酵液[10-11]、植物組織[12-13]甚至動物組織[14]。然而單一運用大孔吸附樹脂難以獲得高純度化合物[15]，往往還需要后續(xù)精制純化手段。高速逆流色譜是一類基于液液分配原理的液相色譜系統(tǒng)[16]，尤其適合天然產(chǎn)物的純化。大孔吸附樹脂與高速逆流色譜均具有成本低、適用范圍廣的優(yōu)勢，因此，關(guān)于二者聯(lián)用分離純化天然產(chǎn)物的研究時常見諸報道[17-18]。

本研究介紹了1種大孔吸附樹脂層析與高速逆流色譜聯(lián)用的技術(shù)；首先接種禾谷鐮刀菌菌株P(guān)H-1至大米培養(yǎng)基中進(jìn)行固體發(fā)酵，之后以甲醇水溶液(體積分?jǐn)?shù)為85%)提取發(fā)酵物中的DON，提取物經(jīng)大孔吸附樹脂初步純化后，用高速逆流色譜進(jìn)行精制，最終獲得純度達(dá)96.78%的DON化合物，每批次可以獲得500 mg以上的毒素純品，為后續(xù)毒素降解研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑 DON毒素標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海Romer Labs公司；色譜純甲醇，購自德國Merck公司；CDCl3，購自美國Cambridge Isotope Laboratories公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

大孔吸附樹脂XAD-2、XAD-4、XAD-7HP、XAD-11180、XAD-1180N與陰離子交換樹脂F(xiàn)PA91-OH、IRA67均購自美國Sigma-Aldrich公司。大孔吸附樹脂在使用之前均用甲醇浸泡24 h，再用去離子水徹底沖洗至流出液不含甲醇，陰離子交換樹脂在使用之前以飽和NaCl溶液浸泡24 h，再用去離子水徹底沖洗。

大米培養(yǎng)基成分為350 g大米與120 mL去離子水，混合均勻后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理。

1.1.2 儀器 主要儀器包括OptiChrome-300 PLUS(高速逆流色譜儀)，江陰逆流科技公司；Waters e2695高效液相色譜儀(HPLC)，美國Waters公司；AB Sciex 5600(高分辨質(zhì)譜儀)，美國AB Sciex公司；DRX-600(核磁共振波譜儀)，德國Bruker公司。

1.2 DON的分析定量方法

利用Waters e2695高效液相色譜儀檢測樣品中的DON含量，采用外標(biāo)法對DON進(jìn)行定量。色譜柱為ACE C18柱[十八烷基硅烷(ODS)，4.6 μm×150 mm，5 μm，Phenomenex]，柱溫為35 ℃，流動相為33%甲醇水溶液，流速為0.6 mL/min，檢測波長為218 nm。該色譜條件下DON的保留時間為6.8 min。

每組試驗均設(shè)置3組平行試驗，最終檢測結(jié)果以3組試驗的平均值表示。

DON在樹脂上的吸附率用如下公式表示：

式中：Qe表示樹脂吸附容量(μg/g)；C0、Ce分別表示樣品溶液初始DON濃度以及吸附后殘留DON濃度(μg/mL)；V0表示初始樣品溶液體積(mL)；m表示樹脂質(zhì)量(g，干質(zhì)量)。

1.3 固體發(fā)酵與樣品制備

將禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)接種至PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)7 d，將菌絲體接種至大米培養(yǎng)基上，于 25 ℃ 培養(yǎng)21 d。

發(fā)酵結(jié)束后將大米烘干，粉碎；用1 L 85%甲醇溶液提取DON毒素，共提取2次，合并提取液，減壓蒸餾至干，殘余油狀物即為供試樣品。

1.4 大孔吸附樹脂柱色譜參數(shù)優(yōu)化

1.4.1 不同樹脂對DON的吸附容量測定 用10%乙醇溶液重懸供試樣品，至DON終濃度約為500 μg/mL。取50 mL溶液加入250 mL三角燒瓶中，加入1 g預(yù)處理樹脂，室溫下振蕩吸附12 h。取上清溶液，以甲醇稀釋10倍后用HPLC法檢測DON含量。

1.4.2 XAD-4樹脂吸附條件的優(yōu)化 取1 g預(yù)處理的 XAD-4樹脂，加至50 mL供試溶液中，分別調(diào)節(jié)供試溶液pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)以及吸附溫度(25、30、35、40 ℃)，振蕩吸附12 h。取上清溶液，以甲醇稀釋10倍后用HPLC法檢測DON含量。

1.4.3 吸附等溫線方程 分別取1 g預(yù)處理的XAD-4樹脂，加入含有不同濃度DON的供試溶液，以最佳吸附條件靜態(tài)吸附2 h，取上清用HPLC法檢測殘余DON含量，計算不同濃度下樹脂吸附容量，并作出吸附等溫線。

采用Langmuir吸附模型與Freundlich吸附模型擬合吸附行為。

Langmuir吸附方程：

Freundlich吸附方程：

式中：Qe為吸附容量；Ce為吸附達(dá)到平衡時溶液中DON濃度；Qm為Langmuir模型中的理論最大吸附量；KL、KF、1/n為經(jīng)驗常數(shù)。

1.4.4 洗脫條件的優(yōu)化 稱取9份已吸附飽和的XAD-4樹脂各1 g，分別用不同質(zhì)量濃度的乙醇溶液進(jìn)行解吸附，檢測洗脫溶液中的DON濃度。

確定最優(yōu)洗脫濃度后，取20 g吸附飽和的XAD-4樹脂裝入玻璃層析柱，以乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2 BV/h，分部收集流出液，檢測DON濃度。流出液經(jīng)減壓蒸餾至干，供高速逆流色譜分離純化。

1.5 高速逆流色譜純化DON毒素

將去離子水與等體積乙酸乙酯混合，充分混勻后靜置過夜分層，分離上下相，即為高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)。將上相以20 mL/min流速泵入高速逆流色譜，隨后以1.5 mL/min流速泵入下相，同時開啟旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速設(shè)置為1 040 r/min，待系統(tǒng)平衡。

將經(jīng)大孔吸附樹脂處理后的樣品用少量下相溶解，通過進(jìn)樣閥泵入高速逆流色譜儀，以1.5 mL/min流速洗脫，檢測波長為220 nm。

分部收集流出液，合并富含DON的餾分，通過N2吹掃去除部分溶劑，剩余溶液置于冷藏室進(jìn)行結(jié)晶，將得到的晶體分別以色譜純甲醇或CDCl3溶解，用LC-MS(液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)與NMR(核磁共振)法測定其分子量及分子結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

本研究選取了5種大孔吸附樹脂與2種陰離子交換樹脂(表1)，分別檢測其對發(fā)酵提取物中DON的吸附能力。靜態(tài)吸附試驗結(jié)果表明，XAD-4樹脂對于DON的吸附容量最高，達(dá)545.76 μg/g(圖1)，因此選用XAD-4樹脂作為吸附劑進(jìn)行DON毒素的純化。

從表1可以看出，陰離子交換樹脂對于DON的吸附能力明顯低于大孔吸附樹脂，考慮到陰離子交換樹脂的吸附取決于被吸附物質(zhì)的解離狀態(tài)，因此，筆者推測在中性pH值條件下DON主要以分子形式存在。

2.2 吸附參數(shù)的優(yōu)化

由于環(huán)境因素如溫度、pH值等均會對大孔吸附樹脂的吸附容量產(chǎn)生影響，因此對吸附時的溫度、pH值均進(jìn)行了初步優(yōu)化。從圖2-A可以看出，隨著溫度的上升，DON的吸附容量逐漸降低。由于吸附過程在通常情況下是放熱行為，因此該現(xiàn)象符合勒夏忒列原理。從圖2-B可以看出，當(dāng)吸附溶液pH值在7～8范圍內(nèi)時，DON的吸附容量最高，但在一個較廣泛的pH值5～9范圍內(nèi)，DON的吸附容量沒有明顯變化，說明DON在此pH值范圍內(nèi)并無明顯解離現(xiàn)象。

表1 選用的樹脂及其理化性質(zhì)

注：ND表示無可靠數(shù)據(jù)。

2.3 吸附行為熱力學(xué)研究

在描述吸附行為時，Langmuir吸附模型與Freundlich吸附模型是最為常用的2種熱力學(xué)模型。通常來說，Langmuir吸附模型更適合用于描述單分子層吸附行為。2種吸附模型的具體參數(shù)見表2?？梢钥闯?，在溫度為25 ℃條件下，XAD-4對DON的吸附行為更符合Langmuir吸附模型，其線性方程的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 7，而Freundlich吸附模型中線性方程的相關(guān)系數(shù)只有0.790 4。表明XAD-4樹脂對DON的吸附行為更符合單分子層吸附模式，XAD-4樹脂在25 ℃條件下對DON的理論最大吸附量為769.23 μg/g(圖3)。

2.4 洗脫條件的優(yōu)化

由于乙醇溶液具有廉價易得、低毒環(huán)保的優(yōu)點，因此通常情況下均采用乙醇溶液作為大孔吸附樹脂的洗脫溶液。本試驗中篩選了質(zhì)量濃度范圍在10%～100%的乙醇溶液，分別考察其對XAD-4樹脂吸附DON的洗脫能力。從圖4-A可以看出，當(dāng)乙醇濃度達(dá)30%時，其對DON的洗脫率已超過80%，因此，選擇30%乙醇溶液作為洗脫溶劑。

表2 XAD-4樹脂對DON吸附行為的Langmuir與Freundlich等溫吸附模型參數(shù)

之后又采用20 mL大孔吸附樹脂柱進(jìn)行動態(tài)洗脫，洗脫溶劑為30%乙醇溶液，洗脫曲線見圖4-B，可見DON在 3 BV 范圍內(nèi)即可基本洗脫完畢。

2.5 高速逆流色譜的最終純化

采用高速逆流色譜作為最終純化手段，選用相關(guān)文獻(xiàn)報道的溶劑體系[7]，以乙酸乙酯-水(體積比=1 ∶1)作為雙相體系，采用有機相作為固定相，以水相作為流動相，對經(jīng)過大孔吸附樹脂初步純化的樣品進(jìn)行精制。從圖5可以看出，DON組分在150 min開始流出，至180 min基本結(jié)束。收集相關(guān)組分，經(jīng)過N2吹掃出去部分溶劑后，采用低溫結(jié)晶的方法獲得DON晶體，通過HPLC及NMR檢測其純度，得到的DON晶體純度達(dá) 96.78%(圖6)，最終回收率為76.20%。

3 結(jié)論與討論

本研究介紹了1種通過大孔吸附樹脂柱層析與高速逆流色譜聯(lián)用技術(shù)分離純化真菌毒素DON的方法，通過該方法可以獲得純度達(dá)96.78%的DON純品，并且一個批次可以制備超過500 mg毒素純品。該方法較為簡便，并且步驟較少，易于放大，因此有助于快速獲得大量毒素純品以供后續(xù)相關(guān)研究。

目前，大孔吸附樹脂純化技術(shù)常用于液體樣品的凈化處理，但限于DON毒素在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)量較低，因此本研究采用大米發(fā)酵物作為毒素來源，導(dǎo)致雜質(zhì)較多，前處理步驟較為繁瑣。在后續(xù)研究中，筆者計劃對液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，同時擬對高產(chǎn)毒菌株進(jìn)行基因操作，以期獲得能夠在液體培養(yǎng)基中大量產(chǎn)生毒素的菌株，便于進(jìn)一步放大毒素生產(chǎn)規(guī)模。