楊 婷， 李仟仟， 史紅安， 吳梅風(fēng)， 張志林， 王立華

(1.湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北孝感 432000；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430062)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellial)植物，為我國(guó)特有的優(yōu)質(zhì)食用油料植物[1]。茶油易被人體吸收，且煙點(diǎn)高，不含對(duì)人體有害的黃曲霉毒素、棉酚、芥酸等成分[2-3]。此外，茶油還具有保健功能，能提高人體免疫能力，減輕脂肪堆積，降低血漿中膽固醇濃度，有效改善和預(yù)防高血壓、冠心病、動(dòng)脈硬化等心血管疾病[4-6]，是一種高檔的保健食用油。茶油被聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織作為重點(diǎn)推廣對(duì)象[7]。但是隨油茶種植面積的增加，油茶病害日趨嚴(yán)重，生產(chǎn)綠色無公害茶油，已成為我國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展急需解決的關(guān)鍵問題[8]。

油茶炭疽病病菌(Colletotrichumgloeosprioides)是油茶的主要病害之一，嚴(yán)重影響油茶的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[9]。萜類化合物為植物代謝的主要產(chǎn)物，具有抑菌活性強(qiáng)、低毒、易降解、不污染環(huán)境、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，是一種安全高效的天然殺菌劑[10-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，萜類化合物中香芹酚、丁香酚、異丁香酚對(duì)油茶炭疽病病菌具有較好的抑制活性。本試驗(yàn)研究香芹酚、丁香酚、異丁香酚對(duì)油茶炭疽病病菌細(xì)胞膜通透性、可溶性蛋白和還原糖含量的影響，了解其作用機(jī)制，以期為將香芹酚、丁香酚、異丁香酚開發(fā)成天然殺菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試萜類化合物

香芹酚(carvacrol)、丁香酚(eugenol)、異丁香酚(isoeugenol)購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度大于95%。

1.2 供試病原菌

油茶炭疽病病菌從湖北省孝感市區(qū)植物病株上采得，采用常規(guī)組織分離法分離純化病原菌，并觀察其形態(tài)學(xué)特征，同時(shí)結(jié)合rDNA-ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列分析，對(duì)病原菌進(jìn)行分離和分子鑒定得到[12]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 萜類化合物對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響 在無菌條件下，用6 mm打孔器在培養(yǎng)好的供試菌菌落邊緣打取長(zhǎng)勢(shì)相同的菌餅接入萜類化合物系列濃度梯度為50、100、200、400 μg/mL 的PDA培養(yǎng)基平板中，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，以不加藥的PDA平板作為對(duì)照，培養(yǎng)6 d后，挑取菌落邊緣的菌絲，在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化。

1.3.2 細(xì)胞膜通透性試驗(yàn) (1)菌絲體培養(yǎng)。將油茶炭疽菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，取直徑為6 mm的菌餅數(shù)，放入含有200 mL PD培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)7 d(28 ℃，180 r/min)。在無菌條件下將菌絲團(tuán)取出，用滅菌的去離子水沖洗3次后，再用布氏漏斗抽濾，收集菌絲體。

(2)電導(dǎo)率測(cè)定。稱取1 g菌絲，放入含有100 mL滅菌去離子水的三角瓶中，分別加入香芹酚、丁香酚、異丁香酚至系列濃度梯度(50、100、200、400 μg/mL)，以無菌去離子水加溶劑作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，于搖床上振蕩培養(yǎng)(28 ℃，180 r/min)，室溫下，于0、30、60、90、120 min時(shí)測(cè)定電導(dǎo)率。根據(jù)下式計(jì)算各處理隨時(shí)間的延長(zhǎng)引起的電導(dǎo)率增加的幅度：

電導(dǎo)率增幅=(不同時(shí)間電導(dǎo)率-0 min時(shí)的電導(dǎo)率)/0 min時(shí)的電導(dǎo)率×100%。

1.3.3 可溶性蛋白含量測(cè)定 (1)菌絲體培養(yǎng)。具體方法同“1.3.1”節(jié)。

(2)酶液制備。稱取5 g菌絲，放于含有100 mL PD培養(yǎng)基的三角瓶中懸浮，分別加入香芹酚、丁香酚、異丁香酚至系列濃度梯度(50、100、200、400 μg/mL)，以無菌去離子水加溶劑作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。處理12 h后，在無菌條件下將菌絲取出，用磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH值為7.5)沖洗2次，之后用布氏漏斗抽濾。稱取0.5 g菌絲，移入加有2 mL磷酸緩沖液的研缽中，冰浴下研磨至糊狀，加入磷酸緩沖液至體積為10 mL，于4 ℃離心(12 000 r/min)15 min，收集上清液備用。

(3)可溶性蛋白含量的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量，吸取1 mL酶液至10 mL離心管中，再加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán)，搖勻，靜止5 min，以1 mL蒸餾水+5 mL考馬斯亮藍(lán)作為空白對(duì)照，于595 nm測(cè)定吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3次。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量，根據(jù)以下公式計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量(mg/g)：

樣品中蛋白質(zhì)含量=C×Vt/(Vs×WF×1 000)。

式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得含量μg/g；Vt為提取液總體積，mL；Vs為測(cè)定時(shí)加樣量，mL；WF為樣品鮮質(zhì)量，g。

1.3.4 還原糖含量的測(cè)定 菌絲體培養(yǎng)同“1.3.1”節(jié)，酶液制備同“1.3.3”節(jié)。還原糖含量的測(cè)定：用二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)還原糖含量，取制備的酶液1 mL，空白對(duì)照用去離子水代替，加入2 mL DNS，于沸水中加熱5 min，取出后立即浸入冷水中冷卻至室溫，再加去離子水定容至10 mL，在540 nm處比色并記錄D540 nm，重復(fù)3次，取平均值。還原性糖含量(mg/g)計(jì)算公式如下：

樣品中還原糖含量=(a×Vt/V)/m。

式中：A為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的還原糖含量，mg/g；Vt為提取液總體積，mL；V為測(cè)定液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Execl 2010和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，處理間差異多重比較采用Duncan氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響

由酚類對(duì)供試病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果(圖1)可以看出，香芹酚、丁香酚、異丁香酚對(duì)供試菌具有明顯的抑制作用，且菌落直徑隨著酚類物質(zhì)濃度的增加而變小。同時(shí)，經(jīng)醛類化合物處理后的菌絲粗細(xì)不均、畸形、發(fā)生扭曲、分支增多(圖2)。

2.2 對(duì)油茶炭疽菌細(xì)胞膜通透性的影響

酚類物質(zhì)對(duì)油茶炭疽菌菌絲電導(dǎo)率變化的測(cè)定結(jié)果表明，油茶炭疽菌菌絲處理液的電導(dǎo)率均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，且電導(dǎo)率增幅均隨著酚類物質(zhì)濃度的增大而増大(圖3～圖5)。

香芹酚處理30 min時(shí)，50、100 μg/mL濃度的電導(dǎo)率增幅變化不大；當(dāng)處理時(shí)間大于30 min時(shí)，濃度為 100 μg/mL 的電導(dǎo)率增幅明顯高于濃度為50 μg/mL的。丁香酚處理 30～60 min時(shí)，50、100、200 μg/mL濃度處理下的電導(dǎo)率增幅較小，60 min后電導(dǎo)率增幅隨著濃度的增加而上升。異丁香酚處理濃度為50 μg/mL時(shí)，電導(dǎo)液的電導(dǎo)率與對(duì)照無明顯差異，在100、200、400 μg/mL濃度下，電導(dǎo)液的電導(dǎo)率增幅明顯高于對(duì)照。

2.3 油茶炭疽菌菌絲的可溶性蛋白含量

處理12 h后，油茶炭疽菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果表明，油茶炭疽菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量均隨著濃度的降低而下降(表1)。當(dāng)香芹酚、丁香酚、異丁香酚濃度為400 μg/mL時(shí)，可溶性蛋白含量最低，分別為7.55、7.69、8.01 mg/g，與對(duì)照相比分別下降了46.49%、45.50%、43.23%。

2.4 還原糖含量的測(cè)定結(jié)果

由表2可以看出，經(jīng)香芹酚、丁香酚、異丁香酚處理后，膠孢炭疽菌菌絲體內(nèi)還原糖含量都隨著濃度的升高而下降，當(dāng)酚類物質(zhì)濃度為400 μg/mL時(shí)，還原糖含量最低，分別為 4.95、6.18、5.71 mg/g，較對(duì)照分別下降59.82%、49.84%、53.65%。

3 討論與結(jié)論

菌體細(xì)胞膜為菌體的保護(hù)屏障，能調(diào)節(jié)和選擇物質(zhì)進(jìn)出。

表1 3種酚類物質(zhì)對(duì)油茶炭疽菌菌絲可溶性蛋白含量的影響

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

膜通透性增大是細(xì)胞膜受到損傷的主要表現(xiàn)之一。細(xì)胞膜受到損害后，其通透性增大，不能有選擇地運(yùn)送細(xì)胞內(nèi)外的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物外泄，使菌絲體失去正常生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，擾亂代謝途徑，從而迫使菌體死亡[13]。

表2 3種酚類物質(zhì)對(duì)油茶炭疽菌菌絲還原糖含量的影響

Odds等研究表明，作用于細(xì)胞膜的抑菌物質(zhì)可使細(xì)胞膜通透性增大，使其內(nèi)含物如蛋白質(zhì)、核酸、還原糖、金屬離子Na+、K+等外泄[14-15]。在本試驗(yàn)中，經(jīng)酚類物質(zhì)處理后，炭疽菌菌體液電導(dǎo)率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而呈逐漸上升的趨勢(shì)，并且隨著酚類物質(zhì)濃度的增加，電導(dǎo)率增幅增加。汪金蓮等研究茶多酚對(duì)稻瘟病菌的抑制得出，茶多酚使稻瘟病菌的細(xì)胞膜通透性增大，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使其失去保護(hù)屏障，由此達(dá)到抑菌目的[16]。由此推測(cè)，酚類對(duì)炭疽菌抑菌活性是其損傷或破壞菌體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致大量?jī)?nèi)含物外泄，最終導(dǎo)致菌體死亡，但是其具體作用位點(diǎn)還須進(jìn)一步研究。

彭璇等研究白薇提取液對(duì)意大利青霉的抑菌機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，其提取液可以降低意大利青霉菌菌絲體內(nèi)總糖、可溶性蛋白含量[17]。蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分之一，是菌絲維持生命活動(dòng)所需的基本物質(zhì)[18]。菌體內(nèi)蛋白質(zhì)含量減少，會(huì)使菌絲體生長(zhǎng)受到影響。經(jīng)香芹酚、丁香酚、異丁香酚處理后，油茶炭疽菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量都隨著處理液濃度的升高而下降。周夢(mèng)嬌等研究發(fā)現(xiàn)，桂枝提取物對(duì)指狀青霉具有抑制作用，通過測(cè)定其電導(dǎo)率變化、可溶性蛋白質(zhì)和總糖含量，研究其抑菌機(jī)制，結(jié)果表明，指狀青霉金桂枝提取物經(jīng)處理后，菌絲體內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖含量均減少[19]。

還原糖是菌體細(xì)胞的主要能源物質(zhì)之一，是維持病原菌細(xì)胞正常生理代謝所需的能量來源和物質(zhì)基礎(chǔ)，還原糖的利用率直接影響菌絲生長(zhǎng)和繁殖[20-22]。在本研究中，2種病原菌經(jīng)處理后，體內(nèi)還原糖含量減少，且含量隨著酚類物質(zhì)濃度的升高而降低，表明萜類物質(zhì)促進(jìn)菌體細(xì)胞內(nèi)還原糖的分解，使菌體失去能量物質(zhì)，擾亂菌體的生理代謝，從而導(dǎo)致菌體死亡。

綜上述分析，萜類化合物香芹酚、丁香酚、異丁香酚增大了供試菌的細(xì)胞膜透性，使菌體內(nèi)含物外泄或抑制菌體內(nèi)能量物質(zhì)的合成代謝，從而到達(dá)抑菌目的。