王其鵬， 王麗喬， 張巍巍， 袁瑞江， 馮大領

(1.河北農業(yè)大學現代科技學院，河北保定 071000； 2.石家莊市農林科學研究院蔬菜研究所，河北石家莊 050021；3.河北農業(yè)大學生命科學學院，河北保定 071000)

蔥(AlliumfistulosumL.)是百合科(Liliaceae)蔥屬(AlliumL.)多年生草本植物。在我國有3個變種，即普通大蔥(A.fistulosumL. var.giganteumMakion)、分蔥(A.fistulosumL. var.caespitosumMakino)和樓蔥(A.fistulosumL. var.viviparumMakino)，各個變種內還有不同的栽培類型。在北方地區(qū)種植的章丘大蔥、北京高腳白、河北隆堯大蔥、山東萊蕪雞腿蔥等均為普通大蔥的栽培類型[1]。大蔥在我國栽培歷史悠久，不僅作為重要的蔬菜和調味料作物，其食用及藥用價值也不斷被人們發(fā)掘[2-3]，因此大蔥的價值越來越被人們所重視。但長期以來，大蔥育種工作發(fā)展緩慢，大蔥作物的品質和產量潛力尚未被充分挖掘。

EST-SSR是目前分子育種中最常用的分子標記之一。EST-SSR標記來源于表達基因中相對保守的序列，該標記不僅能夠直接反映基因的編碼信息，也為功能基因的直接鑒定提供依據，還可以在種內不同栽培類型、屬內不同種甚至科內不同屬種之間具有較好的通用性[4-7]。日本和美國學者開發(fā)了蔥屬植物的EST-SSR標記[8-10]，進而日本學者Hikaru等利用42個洋蔥SSR、InDel、CAPS、dCAPS標記和212個大蔥SSR標記構建了大蔥基于SSR標記的染色體連鎖圖譜[11]。我國大蔥種質資源豐富，栽培類型多種多樣，分析洋蔥EST-SSR標記在不同大蔥種質資源上的通用性研究還少有報道。本研究選用洋蔥EST-SSR標記對大蔥的多份種質資源進行分析，為大蔥種質資源鑒定、雜種純度分析、親緣關系分析等研究提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及基因組DNA的提取

本試驗材料為31個不同來源的大蔥自交系(表1)，于2015年春季在石家莊農林科學研究院蔬菜研究所大蔥試驗基地取材，在河北農業(yè)大學蔬菜種質創(chuàng)新與利用實驗室內完成。

選取新鮮幼嫩的大蔥葉片，采用常規(guī)CTAB法提取基因組DNA，-20 ℃保存。

1.2 EST-SSR標記來源

EST-SSR標記引自VegMarks網站(https：//vegmarks.nivot.affrc.go.Jp/VegMarks/jsp/index.jsp)，選取洋蔥不同連鎖群上的EST-SSR標記，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表1 大蔥自交系材料

表2 洋蔥不同連鎖群的EST-SSR標記

1.3 PCR反應體系及反應條件

PCR反應體系(10 μL)：DNA模板1 μL，10×DNA Buffer(含Mg2+)1 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 0.8 μL，100 μmol/L 引物各0.5 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 6.1 μL。

PCR反應程序：標記1、2、5、6、8、9、10、11、12、14的反應程序為94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 4 min，終止反應。標記3、4、7的反應程序為94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 4 min，終止反應。標記13的反應程序為94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 4 min，終止反應。

試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 PCR產物檢測

PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView顯色，并在Bio-Rad Universal Hood Ⅱ紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

1.5 數據處理

統(tǒng)計14對引物對31個自交系的擴增結果時，在相同的遷移位置上有帶的計為“1”，無帶的計為“0”，缺失的記為“9”。用數值分類與多變量分析系統(tǒng)(numerical taxonomy and multivariate analysis system，NTSYSpc)軟件進行處理，非加權配對算術平均(unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA)法進行聚類分析，獲得聚類圖和遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 洋蔥EST-SSR標記在不同大蔥自交系中的通用性分析

由表3可知，采用14對來自于洋蔥的EST-SSR引物對31個大蔥自交系進行擴增，除了4號引物外，其余13對引物均在31個自交系中有擴增產物，占檢測引物的92.86%。說明洋蔥的13對EST-SSR引物在大蔥不同自交系的基因組上有良好的通用性。4號引物ACM024未能在大蔥31個不同自交系上擴增到PCR產物，可能是因為該引物為洋蔥特有。ACM024位于洋蔥2號染色體，可用于在分子水平上鑒定大蔥和洋蔥。

2.2 洋蔥EST-SSR標記在大蔥不同自交系中的多態(tài)性表現

由表3可知，在13對有擴增產物的引物中，有多態(tài)性的引物有10對，分別為ACE101、ACE127、ACE113、ACE111、ACE087、ACE088、ACM154、ACE020、ACE044、ACE039，占總引物的71.43%，占有擴增產物引物的76.92%。多態(tài)性表現最好的引物是ACE088，該引物在其中1個自交系中未擴增出條帶，在13個自交系中擴增出2條條帶，在7個自交系中擴增出3條條帶，在9個自交系中擴增出4條條帶，而其他引物只在少數自交系中表現出多態(tài)性。在13對引物中沒有表現出多態(tài)性的是ACM005、ACM071、ACM096。

表3 洋蔥14對EST-SSR引物在31個大蔥自交系的擴增結果

13對引物在31個自交系中共檢測到等位位點28個，平均每對引物可以檢測到2.15個。其中ACM154、ACE020、ACE101、ACE044、ACE039、ACE113可以檢測到2個；ACE111、ACE087、ACE127可以檢測到3個；ACE088可以檢測到4個。

2.3 大蔥31個自交系的聚類分析

由圖1可以看出，在相似性系數0.66水平上，該類群自交系可分為2類，一個是自選材料1，一個是其他類型。在相似性系數0.81水平上，可分為6類，一是自選材料1，二是24，三是5、6、8，四是19、27、23、26、25、29、31、30，五是11、28、15，六是2、3、13、18、20、21、4、16、7、12、17、9、10、14、22。在相似性系數0.72水平上，自選材料1、日本品種山木一本與其他類型關系較遠。從該數據得知，日本引進大蔥品種并沒有嚴格與我國的栽培蔥分開，說明我國大蔥與日本大蔥的親緣關系很近，或同源性較高，沒有因地域差異顯示出大的遺傳距離。

由表4可知，遺傳距離在0～2.11之間，其中遺傳距離最小為0(3與13；23與26；29與31)。遺傳距離最大值為2.11(1與24)。

表4 大蔥31個自交系的遺傳距離

3 討論

研究表明，DNA分子標記可用于蔥屬植物的品種鑒定、多樣性研究、SSR標記的開發(fā)、顏色的改良、可溶性固形物含量、雄性不育系和DNA測序等工作[12]。Kutty等利用90個RAPD引物對24個洋蔥栽培種進行了分類分析[13]；Xu等利用5個RAPD標記對31個大蒜栽培種進行了分類鑒定[14]；我國學者徐啟江等利用ISSR標記對洋蔥種質資源進行了遺傳多樣性分析[15]；高莉敏等開發(fā)了與雄性不育相關的大蔥SCAR分子標記[16-17]；Khar等利用EST-SSR對短日照熱帶印度洋蔥及其相關變種的種群進行了遺傳多樣性分析[18]。但利用EST-SSR標記對大蔥的栽培種進行多樣性分析還少有報道。

有大量研究表明在同屬、同科植物間甚至單子葉植物、雙子葉植物間的EST-SSR標記均有較高的通用性[19-21]。本研究將洋蔥EST-SSR標記應用于尚未大量開發(fā)EST-SSR標記的各個大蔥栽培類型中，具有很高的通用性。該試驗證實洋蔥EST-SSR標記在大蔥不同栽培類型上的通用性比率為92.86%，為大蔥分子標記輔助選擇提供了一些可行的 EST-SSR 引物，降低了單獨開發(fā)大蔥EST-SSR引物的成本。本研究為大蔥遺傳作圖、遺傳多樣性分析、功能基因定位和克隆等提供了有效途徑，同時，也為大蔥種質資源收集、保存、評價及優(yōu)良種源篩選奠定了基礎。

引物的多態(tài)性條帶不僅能說明引物的多態(tài)性，同時也能反映一個群體的遺傳變異程度[22-26]。本研究所用的13對 EST-SSR引物共檢測到28個等位基因位點，平均每條引物2.15個。此結果說明該大蔥群體的遺傳多樣性程度相對較低。這可能是由于大蔥食用、藥用等價值較大，多年來人類有目的性地種植，造成有些基因型丟失，遺傳背景不斷趨于單一化，導致形成了較低的遺傳多樣性。此外，為深入分析大蔥不同栽培種的遺傳多樣性，開發(fā)新的EST-SSR標記勢在必行。