胡軼虹 孫宏俠 白春艷 李宗樹(shù) 劉敏 張明明 呂金珠 楊春麗

(吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

阿爾茨海默病(AD)是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，目前尚無(wú)有效的治療方法。因此，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家一直致力于尋找癥狀早期的診斷性工具〔1〕，以利于早識(shí)別，早干預(yù)。本文在前期工作的基礎(chǔ)上〔2〕，聚焦于輕度認(rèn)知損害(MCI)階段，檢測(cè)患者的血漿miRNA-135a及尿AD7c-NTP水平，探討其作為MCI早期診斷標(biāo)志物的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組 (1)正常對(duì)照(AMC)組，年齡≥60歲，保留正常的日常生活活動(dòng)能力，無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，精神疾病及其他可導(dǎo)致認(rèn)知功能損害的醫(yī)療情況。(2)MCI組，年齡≥60歲，用簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE)及臨床癡呆評(píng)定量表(CDR) 進(jìn)行認(rèn)知功能臨床評(píng)價(jià)。認(rèn)知損害診斷標(biāo)準(zhǔn)：①21分≤MMSE≤28分；②非癡呆；③記憶力減退主訴；④保存一般認(rèn)知功能；⑤較完整的日常生活活動(dòng)能力(允許2個(gè)或更少的問(wèn)題：電話、準(zhǔn)備三餐，理財(cái)，完成家務(wù))；⑥根據(jù)教育程度的校正：12年以下+1分，6年以下+2分。根據(jù)頭電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)影像學(xué)檢查及Hachinski缺血量表評(píng)分分為①血管源性(VD)-MCI組：Hachinski缺血量表評(píng)分≥7分伴有影像學(xué)腦血管病改變；②AD-MCI組：Hachinski缺血量表評(píng)分<4分且無(wú)影像學(xué)腦血管病改變。排除標(biāo)準(zhǔn)：①確診癡呆；②中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、頭顱損傷、癲癇、多發(fā)性硬化、中毒代謝性疾病、帕金森病、顱內(nèi)腫瘤、甲狀腺功能減退；③抑郁癥、精神分裂癥；有酒精或藥物依賴(lài)史；服用相關(guān)改善認(rèn)知的藥物；④合并嚴(yán)重心、肝、腎、腦及造血系統(tǒng)疾病。三組均行全面體格檢查和神經(jīng)系統(tǒng)檢查，實(shí)驗(yàn)室檢查(即血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、維生素B12和葉酸水平、甲狀腺功能、同型半胱氨酸)和神經(jīng)影像學(xué)(MRI或CT)檢查。本研究所有受試者知情同意。篩選2016～2018年吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診及住院患者，根據(jù)入組標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出80例，年齡60～94歲，其中AMC組28例，男13例，女15例，年齡中位數(shù)69歲；VD-MCI組28例，男19例，女9例，年齡中位數(shù)72歲；AD-MCI組24例，男13例，女11例，年齡中位數(shù)73歲。三組性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.199)，年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2血漿標(biāo)本采集 空腹12 h后，用乙二胺四乙酸(EDTA)真空采血管采血，立即在1 380 r/min離心5 min。樣本保存在4℃等待血漿制備，其后用1.5 ml EP管分裝，儲(chǔ)存在-80℃，直到進(jìn)一步使用。

1.3尿液標(biāo)本采集 受試者留取晨尿的中段尿，選取清亮的標(biāo)本，經(jīng)尿液分析測(cè)定，如有下列中任何一種異常即為不合格標(biāo)本：①尿蛋白異常；②尿液中白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)異常或有細(xì)菌生長(zhǎng)；③尿中有結(jié)晶；④尿比重異常；⑤pH異常；⑥尿糖、酮體、硝酸鹽、膽紅素或尿膽原陽(yáng)性。合格的標(biāo)本進(jìn)行離心(2 500 r/min，離心10 min)，過(guò)濾，取上清液置于-80℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩娜∧蛞旱酱嫒氡湓? h內(nèi)完成。

1.4小RNA提取及miRNA-135a測(cè)定 應(yīng)用miENeasy Mini Kit(Qiagen，德國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Qiagen，德國(guó))，2×SYBR qPCR試劑盒(EZBioscience，上海)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-qPCR，以cel-miR-39為外參，使用2-ΔΔCT法計(jì)算miRNA-135a水平。

1.5尿AD7c-NTP測(cè)定 應(yīng)用AD7c-NTP試劑盒(朗頓，上海)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，酶標(biāo)儀450nm測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)、方差分析。miRNA-135a及AD7c-NTP水平與MMSE評(píng)分相關(guān)性用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血漿miRNA-135a水平比較 AMC組血漿miRNA-135a水平為(9.87×10-7±5.66×10-7)，VD-MCI組血漿miRNA-135a水平為(4.17×10-7±8.35×10-8)，AD-MCI組血漿miRNA-135a水平為(2.83×10-7±1.72×10-7)，三組miRNA-135a水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.76，P=0.00)。

2.2各組尿AD7c-NTP水平比較 AMC組尿AD7c-NTP水平為(285.83±89.12)ng/L，VD-MCI組尿AD7c-NTP水平為(353.02±96.96)ng/L，AD-MCI組尿AD7c-NTP水平(418.57±112.32)ng/L，三組尿AD7c-NTP水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.96，P=0.00)。

2.3MMSE評(píng)分與miRNA-135a水平相關(guān)性 對(duì)VD-MCI組MMSE評(píng)分與血漿miRNA-135a水平進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者間無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.20，P=0.31)。對(duì)AD-MCI組MMSE評(píng)分與血漿miRNA-135a水平進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者間無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.24，P=0.25)。

2.4MMSE評(píng)分與尿AD7c-NTP水平相關(guān)性 通過(guò)Pearson相關(guān)性分析，VD-MCI組MMSE評(píng)分與尿AD7c-NTP水平無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.18，P=0.46)。AD-MCI組MMSE評(píng)分與尿AD7c-NTP水平無(wú)顯著相關(guān)性(r=-0.31，P=0.14)。

3 討 論

目前用于AD診斷的特異性生物學(xué)指標(biāo)有腦脊液中β淀粉樣蛋白1～42，總tau蛋白，磷酸化tau181P蛋白〔3，4〕。然而，CSF的侵襲性收集過(guò)程限制了這些檢測(cè)方法的日常臨床使用。miRNA是一類(lèi)非編碼小分子RNA，通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在大腦發(fā)育、神經(jīng)元分化、突觸聯(lián)系和樹(shù)突棘形成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔5〕。miRNA 能夠分泌至血漿或腦脊液等外周體液〔6〕，而且 miRNA 經(jīng)囊泡運(yùn)輸或與高密度脂蛋白緊密結(jié)合，可以在外周體液中穩(wěn)定存在〔7〕；同時(shí)，外周體液中的miRNA 水平隨大腦中 miRNA 水平變化而變化，且變化幅度也十分相近。因此，通過(guò)外周血液檢測(cè)miRNA可能輔助AD診斷。Liu等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型海馬組織中miRNA-135a較野生型小鼠顯著下調(diào)，且AD小鼠模型CSF和血清中的miRNA-135a亦顯著下調(diào)。由于miRNA-135a相對(duì)BACE1和Aβ42而言處于生物級(jí)聯(lián)作用的上游，故miRNA-135a可能對(duì)于AD的早期診斷有潛在幫助。這個(gè)猜想也在與Aβ42陽(yáng)性率的橫向比較中得以印證-外周血miRNA-135a可能是較Aβ42更適宜的AD診斷〔9〕，特別是早期診斷的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-135a在輕度認(rèn)知損害患者中降低，在AD源性MCI中降低更為明顯，證明miRNA-135a可作為AD源性MCI早期篩選診斷標(biāo)志物。

AD7c-NTP由De La Monte等〔10〕于1997年首次在晚期AD患者的顳葉腦組織中用抗胰腺絲蛋白抗體分離并命名，是一種分子量為41 kD的跨膜磷蛋白，主要在神經(jīng)元中表達(dá)，定位于神經(jīng)細(xì)胞的軸突，并且在AD患者腦內(nèi)選擇性增高〔11〕。研究表明，增高的AD7c-NTP可從早期的AD 患者腦脊液及尿樣本中檢測(cè)到，而且腦脊液及尿液中AD7c-NTP水平與癡呆的嚴(yán)重程度相關(guān)〔12〕。 AD源性MCI作為AD的早期有癥狀階段，其腦中發(fā)生的病理變化與AD相似，陳英道等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)AD7c-NTP在AD源性MCI患者的腦脊液及尿液中含量均升高，且診斷的靈敏度及特異度較高。本研究發(fā)現(xiàn)AD7c-NTP在所有MCI的患者中均有升高，但AD源性MCI組升高更為明顯，說(shuō)明AD7c-NTP可作為AD源性MCI篩選診斷標(biāo)志物。而將血漿miRNA-135a與尿AD7c-NTP相結(jié)合，可進(jìn)一步提高診斷的準(zhǔn)確性。