蔣瑞娟， 宋 駿， 何 權(quán)， 徐建國(guó)， 朱 軍， 斯建勇， 李曉瑾*

（1.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，國(guó)家中醫(yī)藥管理局新疆中藥民族藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830002；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

植物內(nèi)生真菌是指在生活史的某一階段或全部階段生活在健康植物組織內(nèi)又不對(duì)植物組織造成明顯病害癥狀的菌株。它不僅可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物有效成分含有量，優(yōu)化生態(tài)環(huán)境，還可以產(chǎn)生一些與宿主植物相似或相同的生物活性成分，因此極具新藥開(kāi)發(fā)前景［1-2］。

新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen 是傘形科阿魏屬植物［3］，全國(guó)僅在新疆伊犁地區(qū)有少量分布［4］，樹(shù)脂為其藥用部位，具有消積、化癥、散痞、殺蟲(chóng)等作用［5］。由于生長(zhǎng)環(huán)境惡劣、花后結(jié)實(shí)即死等生理缺陷以及采膠方式錯(cuò)誤、過(guò)度放牧等人為因素，新疆阿魏已被《中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物名錄》 納入三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)瀕危植物。利用現(xiàn)代技術(shù)手段，研究瀕危藥用植物內(nèi)生真菌的化學(xué)成分對(duì)于緩解瀕危植物壓力、保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重大意義。

目前，課題組從新疆阿魏中分離得到內(nèi)生菌337 株，經(jīng)過(guò)篩選，內(nèi)生菌株Alternaria.sp.TA26-16 具有較好的抗腫瘤活性。本研究對(duì)新疆阿魏內(nèi)生菌株Alternaria sp.TA26-16 固體發(fā)酵產(chǎn)物的甲醇提取物進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中分離得到10個(gè)化合物，且所有化合物均為首次從該菌中分離得到。

1 材料

Bruker AV Ⅲ600 核磁共振波譜儀 （德國(guó)Bruker 公司）；EYEL4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廣州愛(ài)浪儀器設(shè)備有限公司）；SA-1500-1 超凈工作臺(tái)（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）；柱層層析硅膠（青島海洋化工廠）；薄層色譜硅膠板GF254（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）。

內(nèi)生真菌分離自新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所陳娟研究員鑒定為Alternaria sp.TA26-16，菌種保藏于新疆中藥民族藥研究所微生物實(shí)驗(yàn)室， 編號(hào)6626。

土豆培養(yǎng)基，土豆去皮，切成約2 cm3的小塊，加1 000 mL 蒸餾水煮沸20 min，玻棒攪拌，雙層紗布過(guò)濾，取濾液加20 g 葡萄糖、16 g 瓊脂，補(bǔ)足濾液至1 000 mL，自然pH。

大米培養(yǎng)基，取60 g 大米放于錐形瓶中，倒入80 mL 蒸餾水，自然pH，高壓滅菌20 min。

菌株發(fā)酵產(chǎn)物，菌株Alternaria sp.TA26-16 接種于土豆培養(yǎng)基25 ℃下培養(yǎng)5 d，再接種至大米培養(yǎng)基上25 ℃恒溫發(fā)酵培養(yǎng)30 d。

2 提取與分離

用等量甲醇萃取菌株發(fā)酵產(chǎn)物3 次， 每次24 h，得甲醇提取物42 g，再用300 g 硅藻土拌樣，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯洗脫，分別得相應(yīng)部位10.6、9.4、8.7 g。

石油醚部位經(jīng)硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（100 ∶1 ～1 ∶1），得14 個(gè)組分（Fr.2-1～14），F(xiàn)r.2-3 經(jīng)硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯（20 ∶1～1 ∶1） 梯度洗脫，得化合物1（6.4 mg）、2（7.9 mg）。取餾分Fr.2-7 凝膠柱分離，甲醇洗脫，得化合物3（5.3 mg）。取餾分Fr.2-14 硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯（20 ∶1） 洗脫，得化合物4（6.2 mg）。

二氯甲烷部位經(jīng)硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫 （100 ∶0 ～0 ∶100）， 得17 個(gè)組分（Fr.3-1～17），F(xiàn)r.3-3 經(jīng)硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯（60 ∶40） 洗脫，得化合物5（9.2 mg）、6（7.4 mg）。 Fr.3-15 經(jīng)硅膠柱分離， 氯仿-甲醇（30 ∶1） 洗脫得化合物7（6.3 mg）。

乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱分離，氯仿-甲醇梯度洗脫（100 ∶0～0 ∶100），最后用甲醇洗脫。得19個(gè)組分（Fr.4-1 ～19），F(xiàn)r.4-5 經(jīng)硅膠柱分離，氯仿-甲醇（20 ∶1 ～0 ∶1） 梯度洗脫，得化合物8（6.1 mg）。 Fr.3-15 經(jīng)硅膠柱分離， 氯仿-甲醇（30 ∶1） 洗脫，得化合物9（10.8 mg）。Fr.4-13利用半制備液相分離，甲醇-水（75 ∶25），得化合物10（6.5 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色針晶（甲醇）。ESI-MS m／z：415［M ＋Na］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：6.03（1H，d，J ＝9.4 Hz，H-6），5.73（1H，s，H-4），5.26（1H，dd，J ＝8.0，15.2 Hz，H-23），5.20（1H，dd，J ＝8.0，15.2 Hz，H-22），1.05（3H，d，J ＝6.6 Hz，H-21），0.99（3H，s，H-19），0.95（3H，s，H-18），0.93（3H，d，J ＝6.89 Hz，H-28），0.84（3H，d，J ＝7.1 Hz，H-27），0.82（3H，d，J ＝8.1 Hz，H-26）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3） δ：34.3（C-1），34.4（C-2），199.7（C-3），123.1（C-4），164.6（C-5），124.6（C-6），134.2（C-7），124.6（C-8），44.4（C-9），36.9（C-10），19.1（C-11），35.7（C-12），44.1（C-13），156.3（C-14），25.5（C-15），27.9（C-16），55.8（C-17），19.1（C-18），16.8（C-19），39.4（C-20），21.4（C-21），135.1（C-22），132.7（C-23），43.0（C-24），33.2（C-25），19.8（C-26），20.1（C-27），17.8（C-28）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］ 基本一致，故鑒定為麥角甾-4，6，8（14），22E-四烯-3-酮。

化合 物2： 無(wú) 色 油 狀 物。 ESI-MS m／z： 301［M＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CDCl3） δ：7.96（2H，m，H-3，6），7.77（2H，m，H-4，5），4.56（4H，t，J ＝6.0 Hz，H-8，8′），1.96（4H，m，H-9，9′），1.68（4H，m，H-10，10′），1.21（6H，t，J ＝6.0 Hz，H-11，11′）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：134.4（C-1，2），130.9（C-3，8），133.0（C-4，5），170.4（C-7，7′），67.6（C-8，8′），32.8（C-9，9′），21.3（C-10，10′），15.8（C-11，11′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］ 基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸二異丁酯。

化 合 物 3： 白 色 粉 末。 ESI-MS m／z： 282［M］＋。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.37（2H，m，H-9，10），2.37（2H，t，J ＝7.5 Hz，H-2），2.07（4H，m，H-8，11），1.65（2H，m，H-9，10），1.33～1.27（20H，m，H-4-7，12-17），0.91（3H，m，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：180.1（C-1），34.8（C-2），25.2（C-3），30.3-29.9（C-4-7），28.0（C-8，11），130.5（C-9），130.8（C-10），29.8 ～29.4（C-12-15），32.7（C-16），23.2（C-17），14.8（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］ 基本一致，故鑒定為油酸。

化 合 物4： 白 色 固 體。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ：7.93（2H，d，J ＝2.2 Hz，H-2，6），6.91（2H，d，J ＝2.0 Hz，H-3，5），2.58（3H，s，4-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：197.3（1-CHO），130.3（C-1），131.0（C-2，6），115.3（C-3，5），160.3（C-4），26.3（4-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］ 基本一致，故鑒定為對(duì)甲基苯甲醛。

化合物5：白色晶體（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：0.63（3H，s，H-18），0.82（3H，s，H-27），0.83（3H，s，H-26），0.85（3H，s，H-29），0.91（3H，s，H-21），1.02（3H，s，H-19），3.53（1H，m，H-3），5.36（1H，brs，H-6）；13CNMR（150 MHz，CDCl3）δ：37.3（C-1），31.7（C-2），71.8（C-3），42.3（C-4），140.8（C-5），121.7（C-6），31.9（C-7），31.9（C-8），50.2（C-9），36.5（C-10），21.1（C-11），39.8（C-12），42.4（C-13），56.8（C-14），24.3（C-15），29.8（C-16），56.1（C-17），11.9（C-18），19.1（C-19），19.8（C-20），18.8（C-21），36.0（C-22），26.2（C-23），45.9（C-24），29.5（C-25），19.3（C-26），19.8（C-27），23.1（C-28），12.0（C-29）。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)［10］ 基本一致，故鑒定為β-谷甾醇。

化合物6：淡黃色油狀液。ESI-MS m／z：280［M］＋。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.34（4H，m，H-9，10，12，13），2.80（2H，m，H-11），2.33（2H，t，J ＝7.6 Hz，H-2），2.05（4H，m，H-8，14），1.63（2H，m，H-3），1.25 ～1.31（14H，m，H-4-7，H-13-16），0.97（3H，t，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：179.9（C-1），34.1（C-2），24.7（C-3），29.0 ～29.7（C-4-7），27.2（C-8），130.0（C-9），128.1（C-10），27.5（C-11），130.2（C-12），128.1（C-13），27.2（C-14），29.8（C-15），32.0（C-16），22.7（C-17），14.1（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［11］ 基本一致，故鑒定為亞油酸。

化合物7： 白色固體。 ESI-MS m／z：121.06［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：7.02（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-7，8），6.69（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-6，9）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：130.94（C-1），156.70（C-5），116.08（C-6，9），130.85（C-7，8）。以上數(shù)據(jù)與與文獻(xiàn)［12］ 基本一致，故鑒定為2-oxabicyclo ［3，2，2］ nona-5，7，8-triene。

化合物8：淡黃色油狀物。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.04（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-2，6），6.78（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-3，5），2.84（2H，t，J ＝7.1 Hz，H-7），4.24（2H，t，J ＝7.1 Hz，H-8），2.03（3H，s，H-9）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3） δ：129.3（C-1），130.0（C-2，C-6），115.4（C-3，C-5），154.7（C-4），34.1（C-7），65.6（C-8），21.1（C-9），172.1（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］ 基本一致，故鑒定為2-（4-羥基苯基） 乙酸乙酯。

化合物9：黃色無(wú)定型粉末。1H-NMR（acetoned6，600 MHz）δ：7.28（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-6），6.71（1H，d，J ＝2.5 Hz，H-5′），6.61（1H，d，J ＝2.5 Hz，H-3′），6.37（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-4），2.77（3H，s）；13C-NMR（acetone-d6，150 MHz）δ：140.3（C-1），166.7（C-3），102.19（C-4），166.80（C-5），166.81（C-7），154.92（C-2′），160.08（C-4′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］ 基本一致，故鑒定為alternariol。

化合物10：淺紫色非晶粉末。 ESI-MS m／z：272［M］＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：11.79（1H，s，2-OH），10.79（1H，s，10-OH），7.18（1H，brs，H-5），6.71（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-11），6.63（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-9），3.90（3H，s，H-4OCH3），2.72 （1H，s，8-CH3）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6） δ：99.3（C-1），164.6（C-2），98.4（C-3），166.2（C-4），101.6（C-5），137.9（C-6），117.1（C-7），138.6（C-8），103.1（C-9），152.1（C-10），108.6 （C-11）， 158.1 （C-12），164.1（C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］ 基本一致，故鑒定為alternariol-4-methyl ether。

4 討論

內(nèi)生菌在植物中廣泛分布，生物多樣性豐富，參與植物生長(zhǎng)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)［15］，并且參與植物次生代謝成分的轉(zhuǎn)合，是天然產(chǎn)物的重要來(lái)源，其中大部分為新型生物活性物質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景［16］。近年研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌除產(chǎn)生抗癌物質(zhì)外，還可產(chǎn)生具有其他藥用價(jià)值的活性物質(zhì)，如抗生素、植物生長(zhǎng)激素等［17］?，F(xiàn)已有學(xué)者在藥用植物內(nèi)生菌中成功提取分離得到生物堿類、芳香族、萜類及揮發(fā)油類、黃酮類及其苷類、酚類和內(nèi)酯類［18-19］。本研究從新疆阿魏內(nèi)生真菌Alternaria sp.TA26-16 中分離得到10 個(gè)化合物，所有化合物均為首次分離得到，以期為今后藥用植物內(nèi)生真菌的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。