劉溪寧，陳睿，孫雙祥，張志祥

(寧波市惠貞書(shū)院，浙江 寧波 315000)

貝類(lèi)屬于軟體動(dòng)物門(mén)，在世界上的分布十分廣泛，貝類(lèi)的種類(lèi)豐富，目前已知有1.1萬(wàn)余種。物種的分類(lèi)與鑒定對(duì)生物學(xué)研究起基礎(chǔ)性作用，傳統(tǒng)的物種鑒定通過(guò)對(duì)生物外形特征的比較來(lái)鑒定物種。然而，許多貝類(lèi)生物外形差異并不顯著，有些特征可能相重合，甚至?xí)驗(yàn)榄h(huán)境的誘導(dǎo)而出現(xiàn)趨同進(jìn)化的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致隱種的普遍存在[1]。因此，利用傳統(tǒng)鑒定法不僅需要生物學(xué)家極高的專(zhuān)業(yè)知識(shí)素養(yǎng)，而且耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法精準(zhǔn)地對(duì)物種進(jìn)行分類(lèi)。隨著人們對(duì)食品安全的日益重視，以及對(duì)維持海洋生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的迫切需要，分類(lèi)學(xué)急需完成較大的突破。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了物種鑒定技術(shù)的發(fā)展，2003年加拿大生物學(xué)家Hebert教授首次提出DNA條形碼(DNA barcode)技術(shù)[2]。該技術(shù)利用特定的短DNA序列將物種進(jìn)行比對(duì)，是效率較高且準(zhǔn)確的物種鑒定方法。目前該技術(shù)已被運(yùn)用于魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)類(lèi)等物種的分類(lèi)，得到了日益廣泛的關(guān)注[3]。本文主要對(duì)DNA條形碼技術(shù)在海洋貝類(lèi)分類(lèi)中的運(yùn)用進(jìn)行綜述,探討利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行海洋貝類(lèi)分類(lèi)的可行性與優(yōu)勢(shì)，為保護(hù)海洋貝類(lèi)物種多樣性提供更加詳細(xì)的資料。

1 DNA條形碼技術(shù)的起源、發(fā)展與原理

1.1 DNA條形碼技術(shù)的起源與發(fā)展

DNA條形碼是使用標(biāo)準(zhǔn)化的DNA標(biāo)記進(jìn)行物種準(zhǔn)確鑒定的技術(shù)，是運(yùn)用變異較多的和已擴(kuò)增成功的較短標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼片段，在生物種內(nèi)特異性與種間多樣性之間創(chuàng)建的身份鑒定系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速、高效識(shí)別。Arnot等最早提出DNA條形碼的概念，但一直到2003年Hebert提出建立一個(gè)基于DNA條形碼的數(shù)據(jù)庫(kù)以實(shí)現(xiàn)物種的快速鑒定后，DNA條形碼技術(shù)才得到了生物學(xué)界的普遍認(rèn)可并得以快速發(fā)展[4]。2004年，美國(guó)建立了生物信息中心(NCBI)和生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)，將物種條形碼標(biāo)準(zhǔn)DNA存入了GenBank中，在2009年國(guó)際生命條碼實(shí)施之后，一個(gè)基于所有真核生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)鑒定系統(tǒng)逐步建立。另外，信息技術(shù)的發(fā)展為海量數(shù)據(jù)處理提供了工具，推動(dòng)了DNA條形碼技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化使用，生命條形碼協(xié)會(huì)和國(guó)際生命條形碼計(jì)劃還創(chuàng)建了大量針對(duì)各類(lèi)群DNA條形碼的數(shù)據(jù)庫(kù)，如ABBI、All-Lepsh和WoRMS等[5]。

1.2 DNA條形碼標(biāo)記技術(shù)的原理與所選材料

DNA是由4種堿基(A、T、G、C)按照一定的順序構(gòu)成的基因序列，每個(gè)位點(diǎn)均有4種可能選擇，生物特有DNA條形碼標(biāo)簽，僅僅15個(gè)位點(diǎn)就可產(chǎn)生415種選擇[1]。由于有的位點(diǎn)堿基受選擇壓力不隨環(huán)境的變化而改變，所以可以?xún)H考慮蛋白質(zhì)編碼基因，根據(jù)密碼子通用的性質(zhì)，45個(gè)位點(diǎn)便可以形成10億種不同序列。如今的DNA測(cè)序技術(shù)能夠精準(zhǔn)的檢測(cè)一段幾百bp長(zhǎng)度的DNA序列，理論上，一段648 bp的DNA條形碼足以鑒定所有物種。DNA條形碼的原理是選擇高度保守且在物種進(jìn)化水平變異細(xì)微的DNA編碼區(qū)或非編碼區(qū)片段用以鑒定物種，但是找到這種通用標(biāo)準(zhǔn)序列片段比較困難[6]。目前COⅠ、16S rRNA、18S rDNA、Cytb、ITS、rbcSp為常用的幾種通用片段[7-8]。

1.3 DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

1.3.1COⅠ作為動(dòng)物分類(lèi)首選序列的優(yōu)勢(shì)

運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)鑒定物種，首先需要一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)序列用以和樣本的序列進(jìn)行比對(duì)。理想的DNA條形碼序列需符合以下標(biāo)準(zhǔn)。1)序列的兩端保守，能夠設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增的通用引物。2)序列的變異速率適宜，既能夠區(qū)別不同物種的生物，種內(nèi)遺傳變異又較小。線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ基因目前被普遍認(rèn)同為標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物DNA條形碼序列[9-10]，因其具有以下優(yōu)勢(shì)。1)mtCOⅠ基因5’末端約648 bp的序列保守，具引物擴(kuò)增通用性[4]。2)該基因無(wú)內(nèi)含子且嚴(yán)格遵循母系遺傳，重組率低，擁有較高的拷貝數(shù)，從而將PCR擴(kuò)增過(guò)程簡(jiǎn)單化[3]。3)mtCOⅠ序列具有較高的突變率，其堿基可能組合數(shù)遠(yuǎn)大于物種數(shù)。4)mtCOⅠ密碼子第3位堿基的置換頻率高，使其進(jìn)化速率約是12 s DNA和16S DNA的3倍，具更多系統(tǒng)發(fā)育信息[6]。5)mtCOⅠ基因種間遺傳距離基本小于1%，遠(yuǎn)小于種間遺傳距離。Hebert在提出DNA條形碼概念時(shí)，便運(yùn)用COⅠ序列分析了動(dòng)物界11門(mén)13 320個(gè)物種，其中可被明確鑒定的物種數(shù)占比高達(dá)98%[9]，可見(jiàn)使用mtCOⅠ基因作為標(biāo)準(zhǔn)序列的可行性。而目前COⅠ序列更是被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、昆蟲(chóng)類(lèi)等物種的鑒定[11-15]，發(fā)揮了極大的作用。

1.3.2 其他DNA條形碼序列

高等植物的線粒體基因的進(jìn)化速率十分緩慢，因此COⅠ序列并不能夠作為植物的通用DNA條形碼，通常使用cpDNA序列鑒定植物物種[8]。然而，研究結(jié)果顯示，目前全世界高等植物約有30萬(wàn)種，且多倍體植物常見(jiàn)，又具有高種間雜交率，導(dǎo)致單基因組標(biāo)記往往無(wú)法準(zhǔn)確鑒別不同種植物。因此，第三屆國(guó)際DNA條形碼學(xué)術(shù)大會(huì)確定了將葉綠體rbcL與matK的基因組合作為植物DNA標(biāo)準(zhǔn)條形碼，其對(duì)植物的鑒定率達(dá)到了72%[6]；同時(shí)將葉綠體trnH-psbA和ITS作為補(bǔ)充條形碼[16]。但植物標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼至今沒(méi)有確定。菌類(lèi)由于結(jié)構(gòu)十分簡(jiǎn)單，僅形態(tài)鑒定幾乎無(wú)法將其區(qū)分，其條形碼研究主要運(yùn)用rDNA或某些功能蛋白基因，如16S rDNA、ITS、微管蛋白基因等[5]。

1.3.3 DNA條形碼技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)

對(duì)物種的準(zhǔn)確鑒定是描述生物多樣性的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)物種鑒定基于對(duì)物種的形態(tài)觀察與解剖，受物種生長(zhǎng)發(fā)育的階段與環(huán)境，以及鑒定者個(gè)人素質(zhì)的影響。DNA條形碼技術(shù)則可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定法的不足。相對(duì)于傳統(tǒng)法來(lái)說(shuō)，利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定具有以下優(yōu)勢(shì)：1)由于物種生長(zhǎng)時(shí)DNA序列并未發(fā)生變化，因此DNA條形碼技術(shù)不受個(gè)體發(fā)育階段和生長(zhǎng)環(huán)境的影響，準(zhǔn)確性較高；2)操作技術(shù)簡(jiǎn)單，通用性高，可實(shí)現(xiàn)一次性對(duì)大量樣本的鑒定，對(duì)鑒定人員個(gè)人素質(zhì)的要求不高；3)對(duì)樣本要求低，DNA樣本僅0.1 g便足以進(jìn)行鑒定，且不需樣本的高完整性，即使樣本被降解也可用于鑒定，避免了鑒定人員的主觀誤差[17-19]；4)可將數(shù)據(jù)發(fā)送至BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)，從而實(shí)現(xiàn)資源的全球性共享。然而由于部分物種可能存在種內(nèi)分化過(guò)高、種間分化不足的現(xiàn)象，種內(nèi)與種間遺傳距離可能重合，導(dǎo)致鑒定的不準(zhǔn)確；同時(shí)，葉綠體與線粒體遵循單親遺傳，不利于鑒定雜交物種[20]；并且，一些新形成的物種差異可能非常小，能否運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)鑒定這些物種仍存在爭(zhēng)議。遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的完備程度決定了DNA條形碼技術(shù)鑒定物種的準(zhǔn)確性[21]，然而，相對(duì)于龐大的生物物種數(shù)量來(lái)說(shuō)，目前BOLD等數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的DNA序列數(shù)目實(shí)在過(guò)于渺小，積極開(kāi)發(fā)DNA序列是科研工作者們的必經(jīng)之路。

2 DNA條形碼技術(shù)在貝類(lèi)分類(lèi)中的應(yīng)用

2.1 簾蛤目

簾蛤目屬軟體動(dòng)物門(mén)、雙殼綱。在我國(guó)，簾蛤目動(dòng)物分布十分廣泛且數(shù)目繁多，外形相似，依靠形態(tài)學(xué)方法將其分類(lèi)的難度非常大。使用DNA條形碼技術(shù)分類(lèi)則使分類(lèi)難度大大降低。王琳楠等[22]選取了簾蛤目16個(gè)物種110個(gè)個(gè)體進(jìn)行研究，測(cè)得其COⅠ基因序列的種內(nèi)平均遺傳距離為0.010 6，雖然裂紋哥特蛤的遺傳距離達(dá)到了0.018 2，但仍然在DNA條形碼COⅠ基因種內(nèi)遺傳距離2%的界限內(nèi)；種間平均遺傳距離高達(dá)0.388 4，遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離，完全符合作為DNA條形碼基因序列所需滿足的要求。將這些DNA條形碼序列與BOLD中的已知序列對(duì)比，匹配率達(dá)100%。該研究的分類(lèi)結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相同，驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)鑒定的準(zhǔn)確性。孟學(xué)平等[23]通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)樂(lè)、漳州地區(qū)西施舌類(lèi)群與其他地區(qū)的COⅠ基因種內(nèi)遺傳距離過(guò)大，從而證明了福建西施舌是西施舌的一個(gè)亞種。

2.2 珍珠貝亞目

珍珠貝亞目在雙殼類(lèi)軟體動(dòng)物中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值。馮艷微[24]對(duì)扇貝科的8個(gè)種63個(gè)個(gè)體的mtCOⅠ和16S rRNA的部分基因序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明mtCOⅠ種內(nèi)遺傳距離平均0.004 8，種間遺傳距離平均0.284；16S RNA種內(nèi)遺傳距離平均0.001，種間遺傳距離平均0.231；兩者的種間遺傳距離都遠(yuǎn)大于種內(nèi)，存在明顯的條形碼間隙，能夠有效鑒定扇貝科物種，但比較而言，COⅠ基因更適合作為珍珠貝亞目DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)基因。

2.3 貽貝目

貽貝目分布廣泛，具有較高的食用價(jià)值。以往的形態(tài)學(xué)鑒定法往往根據(jù)其殼形、刻紋、閉殼肌痕等特征進(jìn)行分類(lèi)，難度較大。劉君采集了貽貝科3亞科、8屬、11種共52個(gè)樣品并擴(kuò)增其COⅠ基因[25-26]，使用COⅠ的通用引物能夠成功擴(kuò)增10個(gè)種的基因，可見(jiàn)COⅠ引物有較高適用性；結(jié)果顯示，除凸殼肌蛤外，COⅠ基因的種內(nèi)遺傳距離平均小于2%，種間遺傳距離均在20%以上，最大可達(dá)60%左右，完全符合Hebert提出的10x規(guī)則[19]。且貽貝科COⅠ基因的種間遺傳距離明顯大于其他生物類(lèi)群，可見(jiàn)COⅠ基因序列十分適合作為貽貝科的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列。研究同時(shí)表明，凸殼肌蛤之所以種內(nèi)遺傳距離過(guò)大，是因?yàn)榇嬖诰€粒體雙單親遺傳模式，父本線粒體的M和F類(lèi)型都可能遺傳給子代。因此試驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡量避免這種模式的干擾，首選提取貝類(lèi)的閉殼肌組織。

2.4 其他貝類(lèi)

除上述貝類(lèi)之外，DNA條形碼技術(shù)在鑒別其他貝類(lèi)時(shí)同樣被廣泛地運(yùn)用。劉君等[25]將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于牡蠣科(Ostreidae)的48個(gè)樣品，得到30條COⅠ序列和47條16S rDNA序列。經(jīng)過(guò)研究表明COⅠ基因能較好分辨各個(gè)種，16S rDNA能較好的區(qū)分近緣種之外的大部分種類(lèi)。經(jīng)過(guò)遺傳距離法分析證實(shí)，在牡蠣科中的巨牡蠣屬(Crassostrea)為代表的一些種類(lèi)，16S rDNA序列的遺傳變異小于COⅠ序列。由此證明，COⅠ基因的使用效率大于16S rDNA。在對(duì)釘螺屬(Oncomelania)的研究中， 徐玉梅等[27]選取安徽分別代表長(zhǎng)江上、中、下游的3個(gè)地區(qū)水域所采集的釘螺，進(jìn)行COⅠ基因分析，結(jié)果顯示，3種不同水域釘螺種類(lèi)的一致性達(dá)到98%及以上，表明基于COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)在釘螺科應(yīng)用的有效性[16]。

3 前景與展望

海洋貝類(lèi)與人類(lèi)息息相關(guān)，可供食用、藥用或作為餌料，并且醫(yī)學(xué)貝類(lèi)種類(lèi)繁多，是大量的對(duì)人體有害的吸蟲(chóng)或線蟲(chóng)的中間宿主。加快推動(dòng)DNA條形碼技術(shù)在海洋貝類(lèi)分類(lèi)與鑒定中的應(yīng)用，合理正確地對(duì)海洋貝類(lèi)進(jìn)行分類(lèi)，具有很大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。隨著試驗(yàn)的不斷深入，DNA條形碼的數(shù)據(jù)庫(kù)將逐漸被完善，檢索也將會(huì)變得更加便捷高效。雖然DNA條形碼的應(yīng)用前景良好，但它的發(fā)展是建立在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上的。因此，DNA條形碼技術(shù)并不可能取代傳統(tǒng)鑒定法而獨(dú)立存在。我們?cè)诜e極研究DNA條形碼序列的同時(shí)，也應(yīng)時(shí)刻注意與形態(tài)學(xué)的結(jié)合，如此才能夠使DNA條形碼技術(shù)達(dá)到更高的水平。