陶祥生 黃衛(wèi)華

（浙江省慶元縣食用菌科研中心，浙江慶元323800）

灰樹(shù)花（Grifola frondosa），又名栗子蘑、貝葉多孔菌、云蕈、舞茸等，隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota），蘑菇綱（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），薄孔菌科（Meripilaceae），樹(shù)花菌屬（Grifola）。浙江慶元縣有近30年栽培灰樹(shù)花歷史，目前是浙江省唯一的灰樹(shù)花產(chǎn)區(qū)，年栽培量達(dá)1600余萬(wàn)袋，為全國(guó)最大的灰樹(shù)花生產(chǎn)地之一。當(dāng)前慶元縣灰樹(shù)花品種僅“慶灰151”“慶灰152”，品種單一。為此，筆者對(duì)收集野生灰樹(shù)花種質(zhì)資源進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，對(duì)其遺傳特征進(jìn)行初步的分析和評(píng)價(jià)，以期為篩選馴化優(yōu)良灰樹(shù)花菌株及育種材料提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試栽培菌株：3個(gè)栽培菌株為慶元縣食用菌科研中心的慶灰151、慶灰152和河北燕山科學(xué)試驗(yàn)站選育的小黑?。ê颖边w西灰樹(shù)花主栽品種）（表1）。

供試野生菌株：8個(gè)野生灰樹(shù)花菌株均為筆者野外收集分離而得（表1）。

1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：1000 mL水加馬鈴薯200 g（用浸出汁），葡萄糖20 g，瓊脂 20 g。培養(yǎng)基pH自然。

表1 供試野生及栽培灰樹(shù)花菌株

栽培料配方：雜木屑34%，棉籽殼34%，麩皮10%，玉米粉 10%，山表土 10%，石膏粉 1%，紅糖1%。料水比 1∶1.1～1.2，pH 自然。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試灰樹(shù)花菌株拮抗試驗(yàn)

將各參試菌株兩兩組合，分別在每個(gè)組合平板中心線兩側(cè)接入兩個(gè)不同菌株菌絲塊，每個(gè)平板3次重復(fù)。25℃倒置培養(yǎng)，觀察菌絲接觸區(qū)有無(wú)對(duì)峙反應(yīng)。若受檢菌株間無(wú)帶線出現(xiàn)，則表示2個(gè)受檢菌株的基因極相似或相同，說(shuō)明種緣關(guān)系近；若受檢菌株間形成帶線，則表示2個(gè)受檢菌株種緣關(guān)系遠(yuǎn)，是不同菌株。

1.3.2 供試灰樹(shù)花菌株特異性鑒定

檢測(cè)方法采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY∕T 1730－2009《食用菌菌種真實(shí)性鑒定ISSR法》。ISSR檢測(cè)方法嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)NY∕T 1730－2009進(jìn)行操作，選用了標(biāo)準(zhǔn)附錄B中提供的28對(duì)ISSR引物中的20對(duì)進(jìn)行檢測(cè)。每對(duì)引物3次重復(fù)。電泳結(jié)果拍照并統(tǒng)計(jì)條帶差異。另外，采用SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行補(bǔ)充鑒定。反應(yīng)體系為：總體積25 μL，包括10×PCR buffer（Promega）2.5 μL，25 mmol∕L MgCl2（Promega）1.8 μL，模板（50 ng∕μL）1.0 μL，正反向引物（20 μmol∕L）各0.38 μL，Taq 酶（5 U∕μL）（Promega）0.3 μL，10 mmol∕LdNTPs 0.5 μL。反應(yīng)條件為94℃ 5 min，前5個(gè)循環(huán)，94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，后35個(gè)循環(huán)退火溫度為50℃，最后72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL PCR產(chǎn)物于1.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，拍照記錄。選取特異性較好的20對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，每對(duì)引物3次重復(fù)。

表2 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

1.3.3 供試菌株菌絲生長(zhǎng)比較

將分離純化后的供試灰樹(shù)花菌株轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫暗培養(yǎng)15 d，用打孔器取直徑為5 mm菌餅接種到PDA培養(yǎng)基平板中央，置于25℃恒溫暗培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況，并采用“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑，之后每天測(cè)量一次菌落直徑，連續(xù)測(cè)量8 d，每種處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度，觀察記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)。

1.3.4 供試灰樹(shù)花出菇對(duì)比試驗(yàn)

栽培袋（15 cm×50 cm×0.005 cm）裝濕料1.7～1.9 kg，98～100℃滅菌14～15 h后冷卻，接種。每袋接種3穴，接種后再套外袋。

取5袋，25℃暗培養(yǎng)，菌絲萌發(fā)后開(kāi)始測(cè)量，每2d劃線1次。記錄接種到菌絲長(zhǎng)滿袋的時(shí)間、接種到形成子實(shí)體的時(shí)間。觀察比較菌棒發(fā)菌差異。

菌絲長(zhǎng)滿袋（40～45d），第1次刺孔增氧，每棒均勻刺孔25～30個(gè)，進(jìn)入后熟期（10～20d），后熟期結(jié)束，就選擇菌絲濃密處割口搔菌（割“V”，長(zhǎng)1.5～2 cm，深約2～3 mm，刮去菌皮及少許培養(yǎng)料，每個(gè)菌棒割口1處），保持空氣相對(duì)濕度85%～90%、溫度22℃左右（恒溫），CO?控制在1000 mg∕kg以下，培養(yǎng)7～10d在割口處即可形成原基。形成原基后移入出菇大棚，增加光照強(qiáng)度（200～500 lx），保持空氣相對(duì)濕度85%～90%，并加強(qiáng)通風(fēng)，一般15～20d后子實(shí)體發(fā)育成熟。采收記錄第一潮袋栽和第二潮覆土出菇產(chǎn)量，計(jì)算袋單產(chǎn)。每個(gè)菌株100棒，3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗試驗(yàn)

拮抗試驗(yàn)結(jié)果供試11個(gè)菌株兩兩組合均發(fā)生拮抗反應(yīng)，說(shuō)明供試菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（表2）。

2.2 特異性分析結(jié)果

將11個(gè)菌株送上海農(nóng)科院食用菌研究所進(jìn)行特異性鑒定?；覙?shù)花待檢菌株與對(duì)照菌株采用20對(duì)ISSR引物及20對(duì)SRAP引物進(jìn)行特異性鑒定。結(jié)果顯示：灰樹(shù)花所有待檢菌株與對(duì)照慶灰151、慶灰152和小黑汀相比均具有特異性，且待檢菌株相互之間也具有特異性。限于篇幅，ISSR擴(kuò)增及SRAP擴(kuò)增譜圖譜略。

2.3 平板培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)情況

11個(gè)供試灰樹(shù)花菌株平板培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 供試灰樹(shù)花菌株平板培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)比較

圖1 2號(hào)灰樹(shù)花菌株子實(shí)體

圖2 8號(hào)灰樹(shù)花菌株子實(shí)體

圖3 14號(hào)灰樹(shù)花菌株子實(shí)體

從菌絲顏色、長(zhǎng)勢(shì)以及形態(tài)來(lái)看，2號(hào)、8號(hào)、14號(hào)、15號(hào)等4個(gè)菌株菌絲表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)勢(shì)，菌絲生長(zhǎng)旺盛，其中14號(hào)菌株菌絲生長(zhǎng)速度最快，但菌絲顏色不如2號(hào)、8號(hào)、15號(hào)潔白。

2.4 栽培試驗(yàn)結(jié)果

灰樹(shù)花栽培從接種到采收所需時(shí)間越短意味著菌袋占場(chǎng)地時(shí)間越短，越有利于降低成本，這是篩選灰樹(shù)花菌株重要指標(biāo)。從表4可以看出，采自于慶元百山祖高海拔地區(qū)的2號(hào)、14號(hào)形成子實(shí)體的時(shí)間較晚，具有馴化和選育低溫型品種的潛力。

表4 供試灰樹(shù)花菌株菌絲滿袋、原基所需形成時(shí)間

供試灰樹(shù)花菌株產(chǎn)量見(jiàn)表5。

從表5中可以看出8號(hào)、14號(hào)、19號(hào)、15號(hào)野生灰樹(shù)花菌株產(chǎn)量較高，接近主栽品種慶灰151、慶灰152。

3 小結(jié)

拮抗試驗(yàn)、分子生物學(xué)鑒定表明，所有野生灰樹(shù)花菌株與對(duì)照慶灰151、慶灰152和小黑汀相均具有遺傳差異性，且供試野生灰樹(shù)花菌株之間也具有遺傳差異性。

表5 供試灰樹(shù)花菌株產(chǎn)量比較

2號(hào)、8號(hào)、14號(hào)、15號(hào)，4個(gè)野生灰樹(shù)花菌株菌絲表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)勢(shì)，菌絲生長(zhǎng)旺盛。

采自于慶元百山祖2號(hào)、14號(hào)形成子實(shí)體的時(shí)間較晚，可以作為選育低溫型灰樹(shù)花品種的種質(zhì)資源。

8號(hào)、14號(hào)、19號(hào)、15號(hào)野生灰樹(shù)花菌株產(chǎn)量較高，接近主栽品種慶灰151、慶灰152有望成為兩品種的后備品種。