崔振澤， 徐超， 遲磊

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytical virus,RSV)感染是引起嬰幼兒時期毛細支氣管炎的最常見病原，發(fā)病率較高，且相當多患兒未來會發(fā)展至支氣管哮喘，嚴重危害兒童健康[1]，其臨床癥狀除表現(xiàn)為典型的咳嗽、氣促外，還會出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉或便秘等胃腸道反應。有多種文獻報道，呼吸道病毒侵害機體后，均可導致腸道組織發(fā)生病理改變[2-3]。祖國醫(yī)學早已有言“肺與大腸相表里”，而現(xiàn)代醫(yī)學也發(fā)現(xiàn)呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)兩大黏膜器官之間有著密切關系[4]。所以說，無論是中醫(yī)還是西醫(yī)都已經(jīng)深刻認識到肺部感染可能導致腸道損傷，也可能進一步影響了腸道菌群的變化。而已知RSV感染患兒常伴有大便性狀和(或)次數(shù)改變，但是否會導致腸道菌群失調(diào)尚不得而知，亦未見相關報道。

代謝組學可以從代謝終端產(chǎn)物的角度整體性和系統(tǒng)性地闡釋中醫(yī)證的實質(zhì)及中藥復方的藥效與作用機制。且前期的研究中發(fā)現(xiàn)，來自《攝生眾妙方》的定喘湯不僅可以抑制RSV病毒復制，而且還可以通過調(diào)節(jié)免疫平衡來達到止咳平喘的功效[5]。本研究建立RSV感染大鼠肺炎模型，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術分析正常對照組、RSV模型組和藥物干預組大鼠血清中代謝物的相對含量變化，以初步闡釋定喘湯調(diào)節(jié)RSV感染大鼠后機體膽汁酸代謝及腸道菌群的作用機制。

1 材料與方法

1.1 病毒 RSV Long株，來源于中國預防醫(yī)學科學院病毒所毒種室，凍存于-80 ℃冰箱備用。測定大鼠RSV病毒半數(shù)致死量LD50為1×10-2/mL。

1.2 動物 健康3周齡左右的SPF級Wistar大鼠27只，雌雄各半，體質(zhì)量均為(30±10)g，由遼寧本溪長生生物技術有限公司提供[許可證號：SCXK(遼)2010-0001]。

1.3 藥物 參照《攝生種妙方》，定喘湯組由麻黃、杏仁、半夏、桑白皮、白果、款冬花各9 g，蘇子6 g，黃芩12 g，甘草3 g組成，以上藥物均購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥局。

1.4 試劑與儀器 Realtime PCR試劑盒(DRR047A，DRR820A，TaKaRa寶生物工程有限公司)；乙腈(Merck,Germany)；甲酸(Sigma-Aldrich,USA)；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)由MilliQ系統(tǒng)制備(Millipore，USA)。7500Real Time PCR儀(美國Applied Biosystems)；Nano2000型超微量紫外分光光度計、低速冷凍離心機(美國，Thermo)；電泳儀(DYY-10C)；MicroChemi 4.2化學發(fā)光成像系統(tǒng)；ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)(Waters，USA)；Waters ACQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)(Waters，USA)；AB triple TOFTM 5600質(zhì)譜(Applied Biosystems，USA)。

1.5 方法

1.5.1 定喘湯的制備 10倍量水浸泡30 min，煎煮90 min，趁熱過濾；第2次用8倍量水煎煮60 min。合并2次濾液，再濃縮后制成含生藥2 g/mL的藥液備用。

1.5.2 造模、給藥和模型評價 采用病毒液滴鼻法建立大鼠RSV感染模型。將Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組，即正常組、RSV模型組和定喘湯組，每組9只。除正常組外，其余各組在乙醚麻醉下經(jīng)鼻腔接種RSV Long株病毒液，0.1 mL/只，正常組在同等條件下接種等量不含病毒的生理鹽水，每日1次，連續(xù)接種3 d。各組在RSV Long株病毒液滴鼻2 h后開始灌胃，定喘湯組給藥劑量相當于60 kg成人臨床等效量，正常組與RSV模型組均予等體積的生理鹽水灌胃，每日1次(人與大鼠等效劑量公式為：大鼠的劑量=6.3X mg/kg)。

模型評價分為一般行為觀察和病理改變兩方面。特征指標測定包括：(1)肺指數(shù)：各組大鼠分別于感染第7天，于無菌條件下取肺組織，稱各組大鼠肺臟重量，計算肺指數(shù)。肺指數(shù)=肺臟重量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。(2)病理切片：取新鮮大鼠肺組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色等處理，中性樹膠封固，觀察各組大鼠肺組織炎癥變化情況。

1.5.3 樣品的采集和處理 正常組、RSV模型組及定喘湯組大鼠分別于感染第3天，摘眼球取血，將血置于血清分離管中，放置2 h，3 000 r/min離心15 min，收集血清，后置于-80 ℃冰箱內(nèi)凍存。

測定前，取血清，室溫解凍，8 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，加入400 μL純水，渦旋1 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液即可。

1.5.4 LC-MS代謝組學分析 液相條件：色譜分離系統(tǒng)采用Waters ACQUITY超高效液相色譜(UHPLC)(Waters，USA)。采用ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱，柱溫60 ℃，進樣量5 μL。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈。洗脫梯度：5% B保持0.5 min，2 min時線性升至60% B，8 min時線性升至100% B，保持2 min，0.1 min內(nèi)回到初始比例5% B以平衡色譜柱，總分析時長12 min。流動相流速為0.4 mL/min。

質(zhì)譜條件：使用AB triple TOFTM 5600質(zhì)譜(Applied Biosystems,USA)作為檢測系統(tǒng)。霧化氣流流速：55 psi；輔助加熱氣流流速：55 psi；氣簾氣流速：35 ps；一級掃描范圍m/z 80～1 000 Da，碰撞電壓10 V；二級掃描范圍m/z 60～1 000 Da，碰撞電壓40 V；正離子噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度550 ℃；負離子噴霧電壓4.5 kV，離子源溫度450 ℃。

2 結果

2.1 定喘湯干預RSV感染大鼠的效應評價

2.1.1 一般行為觀察 RSV感染大鼠后的第3天，與正常組相比，大鼠的精神狀態(tài)、反應度、皮毛狀態(tài)等一般情況發(fā)生了較差的變化；應用定喘湯干預后，大鼠的精神狀態(tài)、反應度、皮毛狀態(tài)等一般情況明顯好轉(zhuǎn)，見表1。

表1 定喘湯對RSV感染大鼠一般狀態(tài)的影響

2.1.2 特征指標測定

2.1.2.1 肺指數(shù) RSV感染組大鼠第3天的肺指數(shù)明顯增加，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與RSV感染組比較，定喘湯組大鼠的肺指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 定喘湯對RSV感染大鼠肺指數(shù)的影響

注：與正常組比較，aP<0.05；與RSV模型組比較，bP<0.05。

2.1.2.2 病理變化 見表3和圖1(見封三)。

2.2 定喘湯干預RSV感染大鼠血清中代謝物譜分析 PCA能從總體上反應各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小，其可以對原始數(shù)據(jù)樣品分布進行總體呈現(xiàn)，考察定喘湯干預RSV感染大鼠后血清中代謝物變化，結果見圖2。如圖所示，正常組、RSV模型組與定喘湯組的血清樣本在PCA得分圖中完全分離，說明3組的血清代謝物譜有明顯的差異，定喘湯可能影響RSV感染大鼠血清中的代謝物，從而對其體內(nèi)的代謝紊亂進行調(diào)節(jié)。

圖2 3組大鼠血清代謝產(chǎn)物散點分布圖

2.3 定喘湯對RSV感染大鼠血清中相關代謝標志物的影響 與正常組大鼠比較，RSV感染組大鼠血清中檸檬酸(CA)、?；悄懰?TCA)、?；切苊撗跄懰?TUDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、7-酮基脫氧膽酸(7-ketodeoxycholic acid)及苯乙酸(Phenylacetic acid)水平顯著升高，甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與RSV模型組比較，定喘湯組大鼠血清中檸檬酸(CA)、?；悄懰?TCA)、牛磺熊脫氧膽酸(TUDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、7-酮基脫氧膽酸(7-ketodeoxycholic acid)及苯乙酸(Phenylacetic acid)均有所回調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 定喘湯對RSV感染大鼠病理變化的影響

表4 定喘湯對RSV感染大鼠血清中代謝產(chǎn)物的影響

注：與正常組比較，aP<0.05；和模型組比較，bP<0.05。

3 討論

在中醫(yī)理論中，“肺與大腸相表里”不僅僅是指肺與大腸的里外深淺等解剖位置，更是以臟腑、氣化和經(jīng)絡為基礎，來詮釋肺和大腸兩者病理生理關系。如《素問·咳論》云：“肺咳不已，則大腸受之；大腸咳狀，咳而遺矢”；又如《癥因脈治泄瀉論》云：“又有痰積在肺肺移于大腸清肺經(jīng)之痰則大腸之瀉自止”，均闡釋了若肺的生理功能運行失常，則易下遺至大腸。臨床實踐也充分證明了這一點，患兒如出現(xiàn)咳嗽、氣促及喘息等癥狀，往往也會合并腹脹、便秘、腹瀉等，且預后往往較差。許多中醫(yī)名家已把“肺腸理論“運用到臨床實踐中多年，療效顯著[6-7]，而定喘湯在治療毛細等喘息類疾病伴惡心、嘔吐、腹瀉癥狀出現(xiàn)時效果也頗為不錯。定喘湯立方旨在宣升開肺，降逆平喘、清熱化痰，方中以麻黃、黃芩、桑白皮宣發(fā)風熱、驅(qū)邪外出，以白果、款冬花、半夏、蘇子、杏仁、甘草降氣化痰，止咳平喘。本方宣升與清降并用，發(fā)散與收斂兼施，從多個方面體現(xiàn)其藥理作用，使氣機升散有度，降泄得宜，可充分發(fā)揮化痰平喘的功效。不僅如此，RSV感染患兒出現(xiàn)的惡心、嘔吐、腹瀉或便秘等胃腸道癥狀通過此方也得到了緩解，無論患兒肺氣上逆出現(xiàn)咳嗽的同時也伴有胃氣上逆所致的惡心、嘔吐，還是內(nèi)熱導致的腹瀉及便秘，定喘湯均可以發(fā)揮其降氣、清熱、收斂澀腸的功效得到解決。故從臨床角度可證實，定喘湯既可治療RSV感染后引起的呼吸系統(tǒng)癥狀，又可緩解其導致的胃腸道癥狀。

RSV感染可使機體膽汁酸代謝發(fā)生改變，同時也間接影響了腸道菌群的變化。人及動物的腸道內(nèi)擁有復雜的微生物群落，并發(fā)揮著生物屏障、免疫調(diào)節(jié)及營養(yǎng)支持等作用，而這其中膽汁酸與腸道細菌卻具有相互依賴、相互競爭、相互抑制的復雜關系[8-9]，因此本實驗通過RSV感染大鼠后機體膽汁酸代謝變化來間接探討了其腸道內(nèi)菌群變化。PCA散點圖顯示，正常組和RSV感染組的血清樣本能夠完全分離，說明兩組的血清膽汁酸代謝物譜有明顯的差異，進而提示RSV感染后機體膽汁酸代謝出現(xiàn)紊亂。結果顯示，RSV感染大鼠后機體檸檬酸(CA)、?；悄懰?TCA)、牛磺熊脫氧膽酸(TUDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、7-酮基脫氧膽酸(7-ketodeoxycholic acid)及苯乙酸(Phenylacetic acid)均發(fā)生改變。脫氧膽酸屬于次級膽汁酸，是初級膽汁酸在腸道內(nèi)受到細菌作用，進行7α脫羥作用生成的膽汁酸；而鵝脫氧膽酸則是次級膽汁酸被腸道的代謝產(chǎn)物重吸收生成的，可見膽汁酸代謝是受腸道菌群影響的。生理狀態(tài)下，腸道內(nèi)膽汁酸激活FXR后，可以維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)，防止細菌移位，抑制有害細菌的生長[10-11]。而本結果顯示RSV感染大鼠后機體膽汁酸代謝產(chǎn)物發(fā)生了變化，這在一定程度上說明了其腸道菌群也相應的發(fā)生了變化，即RSV感染大鼠存在腸道菌群失調(diào)的狀態(tài)。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，病毒可通過黏膜-免疫反應損傷腸道黏膜并改變腸道菌群組成，流感病毒感染小鼠后可使其腸道內(nèi)腸桿菌和腸球菌明顯增加，乳酸桿菌和雙歧桿菌的量則顯著降低[12]，且有文獻報道，在RSV誘導的哮喘急性發(fā)作小鼠模型中，口服約氏乳酸桿菌可以明顯改善RSV誘導的哮喘反應[13]?？梢?，呼吸道病毒感染不僅會導致局部菌群變化如上呼吸道、下呼吸道，還會導致遠端如腸道菌群結構的改變，而腸道的菌群變化反過來通過全身反應又可影響呼吸道的防御作用。

RSV感染大鼠經(jīng)定喘湯干預后發(fā)現(xiàn)，其不僅通過膽汁酸代謝而且可直接通過腸道吸收來調(diào)節(jié)菌群紊亂。大量研究均證明中藥能夠顯著調(diào)整腸道菌群失調(diào)、促進有益菌生長、抑制有害菌過度繁殖，平衡這些益生菌和致病菌的數(shù)量，從而使腸道內(nèi)環(huán)境保持健康的狀態(tài)[14]。PCA散點圖顯示，定喘湯和RSV感染組的血清樣本能夠完全分離，說明兩組的血清膽汁酸代謝物譜有明顯的差異。結果顯示，定喘湯干預后膽汁酸變化趨于平緩變化，各指標均有所回調(diào)，提示定喘湯可能影響RSV感染大鼠血清中的膽汁酸代謝物，從而對其體內(nèi)的膽汁酸代謝紊亂及腸道菌群進行調(diào)節(jié)。其中苯乙酸屬于多酚類，由黃酮類化合物經(jīng)腸道微生物代謝C環(huán)斷開，生成B環(huán)酚酸類物質(zhì)，黃酮醇經(jīng)代謝C環(huán)開裂生成。諸多實驗證明黃酮類化合物對腸道細菌的數(shù)量和種類有一定的影響[15]，某些黃酮類化合物具有抗菌作用，會抑制腸道細菌的生長某些黃酮類化合物及其代謝產(chǎn)物可以刺激降解菌生長使其成為優(yōu)勢菌群。由此可見，腸道菌群在整個過程中起著關鍵作用，與黃酮類化合物在體內(nèi)的代謝密不可分。多酚以及其被腸道菌群代謝的產(chǎn)物，能選擇性調(diào)節(jié)腸道中易感微生物的生長，選擇性的促進有益菌群(如乳酸菌)生長，抑制有害菌的增殖，也即引發(fā)腸道微生態(tài)的改變[16]。

本文通過中醫(yī)“肺與大腸相表里”“肺腸同治”理論，基于在定喘湯干預RSV感染大鼠效應驗證基礎上，應用LC-MC技術分析大鼠血清中膽汁酸代謝產(chǎn)物，結合模式識別和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)7個與定喘湯抗RSV感染作用相關的潛在的膽汁酸代謝標志物，進而驗證了定喘湯不僅可以直接作用于RSV感染引起的肺部炎癥，調(diào)節(jié)免疫平衡，止咳平喘，而且還可通過調(diào)節(jié)機體膽汁酸代謝途徑間接調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，即“肺腸同治”，也為深入探討定喘湯的作用機制和臨床應用提供依據(jù)。