熊海燕，陳 鈞

（武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院，武漢市藥物增溶工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430205）

水產(chǎn)品是人類優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，富含人體必需的8種氨基酸[1]。但由于水分含量較高、組織柔軟，且自身易攜帶大量細(xì)菌，在貯運(yùn)、加工與銷售過(guò)程中，往往容易引起變色、變味，甚至腐敗變質(zhì)，大大降低了食用價(jià)值。因此，對(duì)漁獲后的水產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)及時(shí)采取相應(yīng)的保鮮處理措施，以延長(zhǎng)貨架期。

水產(chǎn)品的保鮮方法有物理、化學(xué)、生物方法等，其中從動(dòng)植物、微生物中提取或利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)得到的生物保鮮劑，如溶菌酶、乳菌鏈球菌素、茶多酚、殼聚糖、蜂膠、植酸、紅曲色素、魔芋葡甘聚糖、生姜汁和魚(yú)精蛋白等，一些安全、營(yíng)養(yǎng)的生物保鮮劑越來(lái)越受人們的關(guān)注。例如，從食品安全級(jí)微生物——乳酸鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取獲得的由34個(gè)氨基酸組成的多肽化合物——乳酸鏈球菌素屬于天然的蛋白類物質(zhì)，對(duì)于人體很安全，其對(duì)細(xì)菌具有形成孔道和抑制細(xì)胞壁合成的雙重作用機(jī)制，對(duì)細(xì)菌芽孢也具有明顯的抗菌活性，從而實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)、純化了用于商業(yè)的細(xì)菌素[2]。納他霉素具有廣譜、高效、安全等特點(diǎn)，主要用于食品表面防腐。魔芋葡甘聚糖是魔芋的主要成分，由葡萄糖和甘露糖按一定比例通過(guò)β-1，4糖苷鍵聚合而成，可抑制微生物的生長(zhǎng)，具有良好的水溶性、膠凝性和成膜性，適合作為涂膜保鮮的基質(zhì)[3]。生姜具有清除自由基、抗炎、抑制超敏反應(yīng)等藥用保健功能，姜汁對(duì)細(xì)菌具有明顯的抑制作用。這些生物保鮮劑可以減少化學(xué)合成殺菌劑對(duì)人類健康的不良影響，有效防止病原菌的抗藥性，被認(rèn)為是食品添加劑研究領(lǐng)域最有前景的發(fā)展方向。

湖北是魚(yú)米之鄉(xiāng)，水產(chǎn)豐富，水產(chǎn)品如何保鮮的問(wèn)題吸引了眾多科研工作者的關(guān)注，以單一因子或通過(guò)柵欄技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行防腐保鮮的研究報(bào)道不斷涌現(xiàn)，其保鮮效果的評(píng)判指標(biāo)主要有感官品質(zhì)、菌落總數(shù)、pH值、水分活度、揮發(fā)性鹽基氮等。而少見(jiàn)以抑菌圈直徑為評(píng)判指標(biāo)進(jìn)行研究。但在微生物學(xué)上，抑菌圈大小是評(píng)判藥劑抑殺菌效果的重要依據(jù)。因此，試驗(yàn)選取乳酸鏈球菌素、檸檬酸、魔芋葡甘聚糖、生姜汁、海藻酸鈉、甘氨酸6種生物保鮮劑對(duì)鯽魚(yú)進(jìn)行保鮮處理，獲得各保鮮劑合適的質(zhì)量濃度，再進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)，比較抑菌作用效果，以期為鯽魚(yú)保鮮提供安全有效的生物保鮮劑。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

（1） 新鮮活鯽魚(yú)。每尾質(zhì)量約500 g，去頭尾、內(nèi)臟，清洗，切成3 cm×4 cm的塊狀，備用。

（2） 試劑。乳酸鏈球菌素、海藻酸鈉、檸檬酸、魔芋葡甘聚糖、甘氨酸，以上試劑均為食品級(jí)、生物試劑；生姜，購(gòu)自學(xué)校附近集貿(mào)市場(chǎng)。

（3） 供試菌種。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

（4） 培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、M-H瓊脂培養(yǎng)基（生物試劑）。

（5）保鮮材料。PE保鮮膜，規(guī)格30 cm×30 m。

1.1.2 儀器與設(shè)備

250B型生化培養(yǎng)箱、DZKW-0-2型恒溫水浴鍋、KK19V41TI型冰箱、ALC210.4型電子天平、SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)、DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 6種生物保鮮劑最佳質(zhì)量濃度的篩選

將生姜榨汁，配成生姜原液，按表1配成相應(yīng)質(zhì)量濃度的生姜汁；選取乳酸鏈球菌素、檸檬酸、魔芋葡甘聚糖、海藻酸鈉、甘氨酸5種保鮮劑，以無(wú)菌水為溶劑，按照表1配制成溶液。將新鮮魚(yú)塊分別放入上述保鮮劑共24瓶溶液中，5 min后取出，采用保鮮膜包好后放入培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h后取出，搗碎，稀釋至1×10-6，分別取1 mL置入無(wú)菌平皿中，傾入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，混勻，于37℃條件下倒置培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。再根據(jù)菌落總數(shù)確定各生物保鮮劑的最佳質(zhì)量濃度。

6種生物保鮮劑最佳質(zhì)量濃度篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.2 6種最佳質(zhì)量濃度生物保鮮劑的抑菌試驗(yàn)

采用篩選出的6種最佳質(zhì)量濃度生物保鮮劑進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。試驗(yàn)流程如下。

表1 6種生物保鮮劑最佳質(zhì)量濃度篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)/g·100 mL-1

配制菌懸液→配制保鮮劑→自制保鮮劑濾紙片→進(jìn)行抑菌試驗(yàn)→測(cè)量抑菌圈直徑。

（1） 菌懸液的制備。將供試菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌分別接種到斜面牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)18～24 h，取出后使用5 mL無(wú)菌生理鹽水洗出，稀釋成質(zhì)量濃度為1×107～1×108CFU/mL的菌懸液置于無(wú)菌操作室內(nèi)備用。

（2） 配制保鮮劑。以無(wú)菌水為溶劑，根據(jù)“1.2.1”的試驗(yàn)結(jié)果配制各保鮮劑溶液100 mL。

（3）自制保鮮劑濾紙片。將定性濾紙用打孔器制備一定數(shù)量的6 mm直徑的圓形小紙片，將其放入潔凈空瓶中包扎，于0.1 MPa壓力下20 min高壓滅菌，取出，置37℃烘箱內(nèi)烘干，在“1.2.2（2）”已配制好的100 mL各保鮮劑中分別放入12片，翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透藥液后取出，放入37℃溫箱內(nèi)稍許烘干備用。另以無(wú)菌水浸過(guò)的濾紙片做空白對(duì)照。

（4）抑菌試驗(yàn)。①倒平板，將M-H瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒平板，要求平皿中培養(yǎng)基為4 mm的均勻厚度。使用前將培養(yǎng)基放在37℃培養(yǎng)箱中培育30 min，使其表面干燥。②接種，無(wú)菌操作，用無(wú)菌吸量管分別吸取培養(yǎng)24 h的供試菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌100 μL菌液到M-H瓊脂培養(yǎng)基中，用無(wú)菌涂布棒進(jìn)行涂布。③貼濾紙條，用無(wú)菌鑷子取自制保鮮劑濾紙片分別貼在平板上。每個(gè)平板貼5片（周?chē)?片為同一種保鮮劑同一濃度濾紙片，中間1片為空白），每片間距不少于為24 mm，紙片中心離皿邊不少于15 mm，在菌接種后15 min內(nèi)貼完紙片。④培養(yǎng)、觀察，將接種后的平板倒置于37℃恒溫箱保溫培養(yǎng)24 h后，取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑大小，記錄并計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種生物保鮮劑最佳質(zhì)量濃度的篩選結(jié)果

通過(guò)平皿計(jì)數(shù)法，得到6種生物保鮮劑不同質(zhì)量濃度處理的菌落總數(shù)大小順序如下：

生姜汁 （g/100 mL） 75＞25＞50＞100，乳酸鏈球菌素 （g/100 mL） 0.15＞0.05＞0.10＞0.20，檸檬酸（g/100 mL）0.40＞0.70＞1.00＞1.30，魔芋葡甘聚糖 （g/100 mL） 0.80＞1.00＞0.60＞0.40，海藻酸鈉 （g/100 mL） 0.50＞1.00＞2.00＞1.50，甘氨酸 （g/100 mL） 0.05＞0.10＞0.15＞0.20。

由此確定各保鮮劑最佳質(zhì)量濃度分別為100g/100mL生姜汁，0.20 g/100 mL乳酸鏈球菌素，1.30 g/100 mL檸檬酸，0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖，1.50 g/100 mL海藻酸鈉，0.20 g/100 mL甘氨酸。

2.2 6種最佳質(zhì)量濃度生物保鮮劑抑菌效果的比較

6種生物保鮮劑體外抑菌效果（X±s，n=4） 見(jiàn)表2。

表2 6種生物保鮮劑體外抑菌效果（X±s，n=4）/mm

由表2可以看出，對(duì)金黃色葡萄球菌，抑菌圈直徑由大到小順序?yàn)?.30 g/100 mLL檸檬酸＞100 g/100 mL生姜汁＞0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖＞0.20 g/100 mL乳酸鏈球菌素=1.50 g/100 mL海藻酸鈉；對(duì)大腸桿菌，抑菌圈直徑大小順序?yàn)?.30 g/100 mL檸檬酸與0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖抑菌效果相當(dāng)，抑菌圈直徑最大，后面依次是100 g/100 mL生姜汁、0.20 g/100 mL乳酸鏈球菌素、1.50 g/100 mL海藻酸鈉；對(duì)枯草芽孢桿菌，抑菌圈直徑由大到小順序?yàn)?.30 g/100 mL檸檬酸＞100 g/100 mL生姜汁=1.50 g/100 mL海藻酸鈉＞0.20 g/100 mL乳酸鏈 球菌素＞0.40 g/100 mL魔芋葡甘聚糖。相比較而言，1.30 g/100 mL檸檬酸抑菌效果最好，0.20 g/100 mL甘氨酸幾乎無(wú)抑菌效果。

3 結(jié)論

從試驗(yàn)結(jié)果看，檸檬酸對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）均有較強(qiáng)的抑菌效果，生姜汁、魔芋葡甘聚糖抑菌效果較好，海藻酸鈉、乳酸鏈球菌素的抑菌效果一般，甘氨酸幾乎無(wú)抑菌效果。

研究選擇的菌種均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)典型菌種，與引起淡水魚(yú)腐敗變質(zhì)的菌種（假單胞菌屬、無(wú)色桿菌屬、黃桿菌屬、摩氏桿菌屬等[4]）存在一定差異。在研究保鮮劑的抑菌效果時(shí)，不同保鮮劑對(duì)不同菌種的抑殺菌效果會(huì)有所不同，但研究方法應(yīng)該是一樣的。試驗(yàn)中1.30 g/100 mL檸檬酸抑菌效果最好，作為一種有機(jī)酸，不僅改變環(huán)境pH值，影響微生物抗熱性，還賦予鮮切鯽魚(yú)一定的酸味，是一種理想的水產(chǎn)品保鮮劑，但到底是單一使用的效果好還是與其他生物防腐劑復(fù)配效果好還需進(jìn)一步探討。