錢家樂 胡福良│編譯

浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058

蜂王漿是哺育工蜂的咽下腺和上顎腺分泌的、用以飼喂蜂王和小幼蟲的漿狀物質(zhì)。蜂王漿的化學(xué)組成復(fù)雜，生物學(xué)活性豐富而顯著，通常認(rèn)為蜂王漿中的脂肪酸和王漿主蛋白是蜂王漿的主要活性成分。1992年，Hanes和Simuth首先發(fā)現(xiàn)蜂王漿中一種相對分子量為57kDa的蛋白質(zhì)，將其命名為“王漿主蛋白”（MRJP）。至今，已經(jīng)從意蜂王漿蛋白中提取分離出9種王漿主蛋白（MRJP1～MRJP9）。2001年，日本學(xué)者M(jìn)asaki Kamakura等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肝細(xì)胞在王漿主蛋白1（MRJP1）影響下能保留不斷生長刺激和細(xì)胞增殖表型，于是又將MRJP1命名為Royalactin。雖然這些研究表明蜂王漿中的蛋白質(zhì)對調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)和命運(yùn)有非常重要的功能性作用，但其作用機(jī)理尚不清楚。2018年12月4日，《Nature Communications》在線發(fā)表了美國斯坦福大學(xué)Kevin C. Wang團(tuán)隊的研究結(jié)果，表明Royalactin具有維持胚胎干細(xì)胞多能性和自我更新的作用。有機(jī)體在Royalactin的幫助下能產(chǎn)生更多的干細(xì)胞來構(gòu)建和修復(fù)自身，也就是說，它能使干細(xì)胞處于一種自我更新的狀態(tài)。

小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）或單卵裂球中分離培養(yǎng)得到的一類細(xì)胞，其主要特點(diǎn)是一方面有自我更新能力，另一方面具有分化成機(jī)體內(nèi)所有其他細(xì)胞的潛能。雖然目前對于控制小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的各種信號通路的解析仍在繼續(xù)，但在體外培養(yǎng)條件下維持干細(xì)胞自我更新或促進(jìn)其分化的方法已經(jīng)十分成熟。在體外培養(yǎng)中，白細(xì)胞抑制因子（LIF）能與胚胎干細(xì)胞表面的一復(fù)合受體（低親和性的LIF受體和普通亞基gp130構(gòu)成異源二聚體）結(jié)合并激活Jak酶，通過對STAT3的磷酸化激活維持細(xì)胞自我更新基因的表達(dá)。另有研究表明，在添加有LIF的無血清培養(yǎng)基中加入2種針對MAPK/ERK激酶（Mek）和糖原合成酶激酶3（GSK3）的小分子抑制劑（2i），能夠有效降低多能性因子的異質(zhì)性表達(dá)，從而使胚胎干細(xì)胞處于類似內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的自然基礎(chǔ)狀態(tài)，能在更加穩(wěn)定的狀態(tài)維持其多能性和自我更新。然而，長期抑制Mek1/2的表達(dá)可能對小鼠胚胎干細(xì)胞的表觀遺傳和遺傳完整性有不利影響，并會明顯限制其發(fā)育潛能。由此，如何用新的方法進(jìn)行體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞并維持其處于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)基態(tài)成為目前亟待解決的問題。

斯坦福大學(xué)Wang團(tuán)隊證實了蜂王漿中的Royalactin可以在無LIF的情況下通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)的可及性來激活體外小鼠胚胎干細(xì)胞的多能基因網(wǎng)絡(luò)，并維持其自我更新。在Royalactin條件下培養(yǎng)的細(xì)胞也能維持在一個更加原始的狀態(tài)，并通過種系傳遞有能力產(chǎn)生嵌合體動物。同時，還證實了一種哺乳動物體內(nèi)存在Royalactin的結(jié)構(gòu)類似物也具有相似的功能，揭示了特定進(jìn)化過程中的分子保守現(xiàn)象。其研究內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下4個方面：

一、Royalactin能有效維持mESCs的自我更新和多能性

Wang團(tuán)隊以小鼠及其胚胎干細(xì)胞作為實驗對象，并主要通過小鼠胚胎干細(xì)胞模型研究Royalactin在哺乳動物中的作用機(jī)制。實驗首先通過將2種不同的mESCs（J1、R1）分別放在3種不同的培養(yǎng)基（血清/-LIF、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin）培養(yǎng)10代、20代。結(jié)果表明，長期處于血清/+LIF培養(yǎng)基條件的mESCs經(jīng)過培養(yǎng)后仍保持自我更新的形態(tài)，而在血清/-LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)的mESCs表現(xiàn)出分化后的形態(tài)。令人驚訝的是，在血清/-LIF+Royalactin培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的mESCs經(jīng)過多代培養(yǎng)仍能在一定程度維持未分化的狀態(tài)，并且mESCs中未分化細(xì)胞的數(shù)量與培養(yǎng)基中Royalactin的劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。細(xì)胞的基因表達(dá)譜也證實了在血清/-LIF+Royalactin和血清/+LIF培養(yǎng)下的細(xì)胞表現(xiàn)出高度的相似性。

在觀察到Royalactin在體外對mESCs有很好的干性維持效應(yīng)后，他們接著對血清/-LIF+Royalactin條件培養(yǎng)下的mESCs能否在體內(nèi)仍能維持胚胎特征和分化潛能進(jìn)行了檢測。他們對該細(xì)胞進(jìn)行皮下移植后培養(yǎng)6周，成功觀察到畸胎瘤的產(chǎn)生。上述研究結(jié)果表明，Royalactin能有效維持mESCs的自我更新和多能性。

二、Royalactin能調(diào)節(jié)染色質(zhì)和多能網(wǎng)絡(luò)

Royalactin對mESCs轉(zhuǎn)錄組有怎樣的影響呢？Wang團(tuán)隊對3種培養(yǎng)基（血清/-LIF、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin）中培養(yǎng)的mESCs進(jìn)行了RNA-seq分析。結(jié)果表明，Royalactin條件下和LIF條件下的mESCs在標(biāo)準(zhǔn)多能基因的高度富集和系列特異性基因的抑制表達(dá)在多個水平都較為相似。由于Royalactin影響下的mESCs中有基因富集的情況，他們對該條件下的所有差異性表達(dá)的基因進(jìn)行了GO term分析，結(jié)果表明Royalactin對mESCs的基因富集主要涉及細(xì)胞增殖和維持細(xì)胞干性等基因表達(dá)的上調(diào)。同樣地，他們分別對3種培養(yǎng)基（血清/-LIF、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin）培養(yǎng)的mESCs進(jìn)行了ATAC-seq分析，結(jié)果表明Royalactin與LIF條件下mESCs的ATAC-seq信號增幅相對于血清/-LIF條件更為相似，尤其是在啟動子、增強(qiáng)子和超級增強(qiáng)子水平。上述的RNA-seq與ATAC-seq的實驗結(jié)果高度相關(guān)，并且GO分析的功能注釋表明ATAC-seq主要落點(diǎn)于與多能性、代謝和分化相關(guān)基因。此外，motif富集分析顯示，Royalactin影響下的超級增強(qiáng)子組分上調(diào)引起了KLF5、KLF4和SOX2等轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合位點(diǎn)的高頻結(jié)合?？偟膩碚f，這表明了調(diào)控序列對Royalactin條件敏感，并能因此調(diào)控下游基因的表達(dá)。

為了加深在分子水平對Royalactin條件下的小鼠胚胎干細(xì)胞基因表達(dá)模式的認(rèn)識以及找尋可能的多能性調(diào)控因子，Wang團(tuán)隊對Royalactin條件下的mESCs進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果表明Stat3、Tfcp2l1、Esrrb以及Nanog等轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)中是最重要的節(jié)點(diǎn)。后續(xù)的實驗表明，Royalactin對磷酸化Stat3以及其他多能因子的刺激有一定程度的劑量效應(yīng)。另外，減少這些轉(zhuǎn)錄因子會極大程度地限制Royalactin對mESCs的作用。這一系列的發(fā)現(xiàn)說明了Royalactin能激活一條非LIF依賴性的信號通路，并且該通路能激活Stat3轉(zhuǎn)錄因子。對血清/+LIF和血清/-LIF+Royalactin條件下培養(yǎng)的mESCs進(jìn)行基因表達(dá)譜分析顯示，有519個基因僅受Royalactin影響并上調(diào)。對這519個基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果表明這些基因主要富集于代謝和生物合成過程，這讓他們聯(lián)想到2種針對MAPK/ERK激酶（Mek）和糖原合成酶激酶3（GSK3）的小分子抑制劑（2i）存在條件下的無血清有LIF的2i培養(yǎng)基。于是他們對血清/-LIF+Royalactin、2i和血清/+LIF培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的mESCs分別進(jìn)行了全基因表達(dá)譜分析和主成分分析。結(jié)果表明，相對于血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin和2i條件下培養(yǎng)的mESCs聚類情況更為明顯?？傊鲜鼋Y(jié)果表明Royalactin會維持mESCs的多能性，并以此猜測Royalactin可能會使mESCs處于自然基礎(chǔ)狀態(tài)。

三、Royalactin促使mESCs的多能性處于類自然基礎(chǔ)狀態(tài)

根據(jù)之前的猜想，Wang團(tuán)隊對Royalactin是否能使mESCs的多能性處于自然基礎(chǔ)狀態(tài)進(jìn)行了驗證。首先通過簡單的對照實驗證實了在2i+LIF和0i+Royalactin培養(yǎng)基中的mESCs的多能性保存效果良好，而0i培養(yǎng)基中的mESCs有明顯的分化現(xiàn)象。另外，將0i+Royalactin培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞注射進(jìn)小鼠的囊胚中，產(chǎn)生的嵌合體后代性狀能進(jìn)行種系傳遞，說明Royalactin在生物體內(nèi)的影響是不損害其健康的。

RNA-seq和GO分析進(jìn)一步說明了2i+LIF和0i+Royalactin培養(yǎng)基培養(yǎng)的mESCs所富集的基因有顯著相似性，對2i+LIF、0i+Royalactin、血清/+LIF、血清/-LIF+Royalactin和血清/-LIF培養(yǎng)基培養(yǎng)的mESCs進(jìn)行全基因譜分析和主成分分析，結(jié)果證實了0i+Royalactin和2i+LIF條件下的細(xì)胞相比其他條件下的細(xì)胞聚類情況更加明顯。對上述條件下培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)代謝、轉(zhuǎn)錄過程以及發(fā)育等過程呈現(xiàn)差異。以上數(shù)據(jù)表明，Royalactin對mESCs的影響伴隨著深刻的代謝重編程，并且類似于2i+LIF條件，Royalactin能促使mESCs模擬小鼠內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞環(huán)境，使其多能性處于類自然基礎(chǔ)狀態(tài)。

四、在哺乳動物體內(nèi)找到Royalactin的類似物

Wang團(tuán)隊想知道哺乳動物體內(nèi)是否存在Royalactin的類似物。通過使用高靈敏的蛋白序列比對方法PSI-BLAST和HHPRED進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索并根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)比對人類和小鼠蛋白質(zhì)。雖然在上述數(shù)據(jù)庫沒有找到Royalactin的直接同源蛋白，但HHpred在PDB數(shù)據(jù)庫中找到了Royalactin的“遠(yuǎn)親”——一種沙蠅的唾液腺分泌的蛋白質(zhì)（SGP）。于是他們以SGP作為模板，在同源建模軟件MODELLER中模擬Royalactin的折疊模式，構(gòu)建了一個高可信度的模型，想憑借此模型重新用更為精準(zhǔn)的HHpred在人蛋白質(zhì)組中搜索，以期找尋該模型的結(jié)構(gòu)功能類似物。最終他們找到唯一與模型相匹配的蛋白質(zhì)，并將其臨時命名為NHL Repeat Containing 3（NHLRC3）。雖然之前對NHLRC3的功能并沒有過任何報道，但他們通過對小鼠胚胎進(jìn)行單細(xì)胞RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)在4.5日齡胚胎中NHLRC3開始表達(dá)，并在此后逐漸提升其表達(dá)量。為證明它與Royalactin有相似的對mESCs的多能性有維持作用，他們將重組后的NHLRC3加入到血清/-LIF培養(yǎng)基中，制成血清/-LIF+NHLRC3（0i+NHLRC3）培養(yǎng)基。經(jīng)過多代培養(yǎng)后，Royalactin和NHLRC3影響下的mESCs都處于未分化狀態(tài)。另外，將0i+NHLRC3條件下培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞注射進(jìn)小鼠囊胚中，并將囊胚發(fā)育成能進(jìn)行種系傳遞的嵌合體動物，說明NHLRC3在生物體內(nèi)的影響是不損害其健康的。因此，NHLRC3被證實為哺乳動物多能性維持因子，它的存在也說明了大分子結(jié)構(gòu)和功能的顯著保守性。由于其和Royalactin有相似的功能，并且在一定程度上可以說是蜂王漿成就了蜂王，因此他們將NHLRC3重新命名為Regina（拉丁語的女王）。

綜上，經(jīng)過一系列的實驗探究，Wang團(tuán)隊證實了Royalactin能維持小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性，并且可以促使其處于自然基礎(chǔ)狀態(tài)；在哺乳動物體內(nèi)還找到了Royalactin的類似物Regina，同時也證實了Regina作為多能性因子也能促使小鼠胚胎干細(xì)胞處于自然基礎(chǔ)狀態(tài)。對于Royalactin和Regina在基因通路和進(jìn)化中保守的生化過程之間交互作用的深刻認(rèn)識，和不同的多能網(wǎng)絡(luò)功能是怎樣單獨(dú)或協(xié)同維持干細(xì)胞自我更新，將會使人類能更好地控制干細(xì)胞的命運(yùn)，并能提供一個進(jìn)一步研究多能狀態(tài)的平臺。對Regina的發(fā)現(xiàn)和探究也因此支持了一個有趣的觀點(diǎn)：即使是進(jìn)化程度極高的特殊性狀也有著極深刻的分子保守性。對于Royalactin和Regina在哺乳動物細(xì)胞中機(jī)械性作用的深刻探究，將會對哺乳動物多能性有更深刻的理解。此外，Royalactin和Regina可以為因細(xì)胞死亡引起的疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ　⑿呐K衰竭和肌肉萎縮等）帶來新療法，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域有著更加深遠(yuǎn)的意義。