趙曉冬 王紅芳 胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018）

銅是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)必需的微量元素，其影響機(jī)體的代謝和生長發(fā)育、免疫功能，其不僅通過構(gòu)成機(jī)體內(nèi)的含銅酶（如超氧化物歧化酶、銅藍(lán)蛋白等）參與機(jī)體代謝過程，而且參與機(jī)體造血、自由基防御等活動(dòng)[1]。蜂蜜是蜜蜂在自然狀態(tài)下主要的能量食物，含有多種礦物質(zhì)。蜂蜜中常見的微量元素包括K、Na、Mg、Zn、Fe 和Cu 等20 多種，常量元素約占所有礦物質(zhì)的98%～99%[2]。Bounias 等研究了有機(jī)銅源葡萄糖酸銅和乳酸銅對(duì)蜜蜂蜂螨防治的效果，發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸銅效果更佳[3]。

銅參與機(jī)體的抗氧化功能主要是通過影響含銅氧化酶的活性而發(fā)揮作用的。銅是銅鋅超氧化物歧化酶的重要組成部分，可以催化機(jī)體代謝的有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為氧自由基和H2O2。蜜蜂中腸位于前胃之后，是消化和吸收的器官。中腸腸腔內(nèi)有多層的圍食膜，可保護(hù)中腸細(xì)胞減少磨損，使中腸消化酶穿過圍食膜消化食物，再由中腸細(xì)胞吸收分解的營養(yǎng)物。在分子水平，低濃度的Cu2+可以食物中銅對(duì)昆蟲生長發(fā)育有重要作用，銅水平對(duì)棕尾別麻蠅的影響得出：飼料中添加低濃度的銅能夠提高棕尾別麻蠅的生理功能，而高濃度的銅則會(huì)產(chǎn)生抑制作用[4]。在蜜蜂人工飼料中添加銅的有機(jī)鹽——葡萄糖酸銅可以提高蜂群的抗病能力，但是銅的適宜添加水平及其對(duì)蜜蜂生理機(jī)能的影響還有待進(jìn)一步研究證明。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物為意大利蜜蜂，取自蜂群健康、群勢基本相同的蜂群。試驗(yàn)用葡萄糖酸銅（山東西亞化學(xué)有限公司），貨號(hào)為L103479-25g，純度為98%。

1.2 意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧配制

試驗(yàn)采用6 種不同銅水平的人工幼蟲飼糧飼喂意大利蜜蜂工蜂，6 種飼糧分別標(biāo)記為A、B、C、D、E、F，飼糧組成見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2017年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院完成，供試蜂場為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗(yàn)蜂場，蜜蜂在30℃和50%±5%R.H.的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)。在飼養(yǎng)過程中保證培養(yǎng)箱和飼喂盒的衛(wèi)生，防止其他不利因素對(duì)蜜蜂產(chǎn)生的影響，飼養(yǎng)至蜜蜂全部死亡。分別于9日齡測定體成分、血淋巴生化指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)、相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量、制作中腸切片，并測定壽命。

1.4 測定指標(biāo)及相關(guān)方法

1.4.1 離群意大利蜜蜂壽命的測定

在23cm×9.5cm×5cm 蜂盒中飼養(yǎng)，并置于培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)恒溫恒濕培養(yǎng)箱的溫度為30℃，濕度為50%±5%，每天定時(shí)記錄死亡的蜜蜂數(shù)，直至蜜蜂全部死亡。

1.4.2 離群意大利蜜蜂工蜂中腸切片的制作

選用組織石蠟包埋切片。

1.4.3 離群意大利蜜蜂蜂體銅含量的測定

從每試驗(yàn)組取9日齡的蜜蜂30 只，每10 只蜜蜂為一個(gè)重復(fù)。采用硝酸-雙氧水消解，ICP-ms 測定銅含量。

表1 飼養(yǎng)離群意大利蜜蜂飼糧組成及銅水平

表2 試驗(yàn)中PCR引物

1.4.4 血淋巴生化指標(biāo)的測定

采用體積為20μl 的毛細(xì)管吸取9日齡蜜蜂血淋巴50μl 于加有苯基硫脲的1.5ml 離心管中，于-80℃進(jìn)行保存。測定時(shí)，4℃條件下3000r/min離心10min，取上清備用，采用日立7020 型全自動(dòng)生化分析儀測定蜂體血淋巴中總蛋白（TP）、總膽固醇（TCHO）。

1.4.5 蜜蜂中抗氧化酶活性的測定

從各試驗(yàn)組9日齡蜜蜂分別取出12 只蜜蜂，每3 只蜜蜂為一個(gè)重復(fù)，使用SOD 試劑盒A007（南京建成生物工程研究所）測定SOD 活性。利用可見光分光光度計(jì)（UV-2000）測定吸光度并計(jì)算蜂體抗氧化能力。

1.4.6 工蜂幼蟲蟲體溶菌酶、防衛(wèi)素1 基因相對(duì)表達(dá)量的測定

采用Trizol 法提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將提取的總RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。目的基因引物設(shè)計(jì)參考序列來自于NCBI 數(shù)據(jù)庫，采用Primer 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，委托生工生物科技有限公司合成引物，引物序列如表2所示。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS 9.2 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan 氏法多重比較，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 銅對(duì)蜜蜂壽命的影響

從蜜蜂存活率曲線圖來看，整個(gè)飼養(yǎng)期間，對(duì)照組A、處理組B、C 存活率明顯高于處理組D、E、F，10 天內(nèi)，各處理組的存活率差異很小，自11 天起，處理組B 存活率明顯高于其他組（見圖1）。

2.2 銅對(duì)蜜蜂中腸圍食膜的影響

圖1 銅對(duì)蜜蜂存活率的影響

圖2-1 A組蜜蜂中腸組織切片，H＆E染色，100×

圖2-2 B組蜜蜂中腸組織切片，H＆E染色，100×

圖2-3 C組蜜蜂中腸組織切片，H＆E染色，100×

圖2-4 D組蜜蜂中腸組織切片，H＆E染色，100×

圖2-5 E組蜜蜂中腸組織切片，H＆E染色，100×

圖2-6 F組蜜蜂中腸組織切片，H＆E染色，100×

圖3 離群蜜蜂體組織銅含量

圖4 飼糧中銅水平對(duì)9日齡蜜蜂血淋巴生化性能的影響

9日齡中腸切片顯示（100×）（見圖2），飼糧中銅的不同添加水平影響離群蜜蜂中腸圍食膜的結(jié)構(gòu)。對(duì)照組A、處理組B、C 蜜蜂中腸的PM 較厚且形態(tài)勻稱，而B 處理組PM 最厚；D、E、F 處理組蜜蜂中腸PM 的厚度不一。當(dāng)飼糧中銅水平為2.00μg/g 時(shí)對(duì)蜜蜂中腸圍食膜的結(jié)構(gòu)相對(duì)來說較為完整。

表3 銅對(duì)離群蜜蜂Cu/Zn-SOD活性的影響

表4 銅對(duì)蜜蜂CAT相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3 銅對(duì)蜜蜂體組織銅含量的影響

由圖3可知，3、6、9日齡體組織Cu 含量也隨飼糧中Cu 水平不斷增加而顯著上升（P＜0.05），對(duì)照組蜜蜂體組織Cu 含量顯著小于其他組（P＜0.05）。

2.4 銅對(duì)蜜蜂血淋巴生化指標(biāo)的影響

由圖4可知，飼糧中銅的添加可顯著影響蜜蜂體中總蛋白、總膽固醇含量（P＜0.05)，隨著飼糧中銅添加水平的升高，9日齡蜜蜂體中總蛋白、總膽固醇含量均下降（P＜0.05)。

2.5 銅對(duì)蜜蜂抗氧化能力及相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.5.1 銅對(duì)蜜蜂抗氧化能力的影響

由表3可知，D 處理組3日齡蜜蜂Cu/Zn-SOD活性顯著高于其他組（P＜0.05），B 處理組6日齡蜜蜂Cu/Zn-SOD 活性顯著高于對(duì)照組A 組以及其他處理組（P＜0.05），3、6日齡蜜蜂Cu/Zn-SOD 活性都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。

2.5.2 銅對(duì)蜜蜂抗氧化相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由表4可知，銅顯著影響9日齡蜜蜂CAT基因表達(dá)量（P＜0.05）。隨著幼蟲飼糧中銅水平的不斷升高，9日齡蜜蜂幼蟲CAT基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。

2.5.3 銅對(duì)蜜蜂高親和力銅吸收蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖5可知，9日齡幼蟲F 處理組Ctr1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組（P＜0.01），隨著幼蟲飼糧中銅水平的不斷增加，9日齡蜜蜂Cu/Zn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢（P＜0.05）。

3 討論

3.1 飼糧中銅的添加水平影響蜜蜂生長發(fā)育

圖5 銅對(duì)9日齡蜜蜂Ctr1相對(duì)表達(dá)量的影響

Adam 等[4]研究表明，Cu2+主要沉積在雙翅目幼蟲中腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)。過量的Cu2+使中腸上皮細(xì)胞發(fā)生變性、腫脹、破裂[5]。本實(shí)驗(yàn)中，在飼糧中添加銅能夠保護(hù)腸道，有助于腸道的生長發(fā)育，當(dāng)蜜蜂飼糧糖漿中銅添加量在2.00μg/g 時(shí)能夠使中腸圍食膜的結(jié)構(gòu)較為均勻完整，有利于提高蜜蜂的健康水平。昆蟲取食含Cu2+的飼料后，Cu2+在體內(nèi)的積累量與飼料中Cu2+濃度存在顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，并隨著取食時(shí)間的延長而增加[6]。在昆蟲體內(nèi)存在毒物興奮效應(yīng)，即低濃度刺激、高濃度抑制的劑量反應(yīng)現(xiàn)象[7]。本研究中高劑量的Cu2+脅迫會(huì)顯著降低昆蟲的總蛋白和總脂濃度。

3.2 飼糧中銅的添加水平影響蜜蜂的抗氧化能力

在昆蟲體內(nèi)存在抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）等[8]。重金屬銅可與酶分子中的其他金屬離子發(fā)生競爭性替代作用而抑制酶活力，使昆蟲體內(nèi)生化反應(yīng)緩慢，并減弱昆蟲清除氧自由基能力，最終抑制昆蟲代謝和生長發(fā)育，延長其發(fā)育歷期。綜合本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中銅的添加水平為2.00～4.00μg/g時(shí)，意大利蜜蜂工蜂的抗氧化狀態(tài)最好。

3.3 飼糧中銅的添加水平影響銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量

銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族主要包括銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ctr）和銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸化ATP 酶（Cu-ATPase）。Ctr1的表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度有密切關(guān)系，其表達(dá)量的多少直接對(duì)機(jī)體銅代謝產(chǎn)生影響，銅缺乏時(shí)可促進(jìn)該蛋白的表達(dá)，過量則抑制其表達(dá)。本研究表明銅的添加對(duì)于蜂體Ctr1的表達(dá)有顯著影響，其相對(duì)表達(dá)量在銅的添加水平0.00～10.00μg/g 的范圍內(nèi)有升高的趨勢，然而目前關(guān)于飼糧中銅水平對(duì)于其代謝相關(guān)酶的影響尚未見報(bào)道。

4 結(jié)論

（1）當(dāng)飼糧中銅的添加水平為2.00μg/g 時(shí)能顯著提高意大利蜜蜂工蜂的壽命，且對(duì)蜜蜂中腸食膜的結(jié)構(gòu)最為有利。

（2）當(dāng)飼糧中銅的添加水平在0.00～10.00μg/g 的范圍內(nèi)不斷升高時(shí)，9日齡蜜蜂體組織銅含量顯著升高，銅對(duì)9日齡意大利蜜蜂過氧化氫酶基因相對(duì)表達(dá)量、高親和力銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量顯著增加，但蜜蜂血淋巴中總蛋白和總膽固醇含量顯著降低。

（3） 6日齡和9日齡蜜蜂蜂體超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）活性隨著銅的添加水平的提高出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，都在2.00μg/g 時(shí)活性最高。

（4） 綜合考慮以上指標(biāo)，推薦意大利蜜蜂工蜂飼糧的適宜銅的添加水平為2.00～4.00μg/g。