邢家偉，許長寶，趙興華，趙永立，呂 遠(yuǎn)，王紅丹

膀胱癌是一種惡性腫瘤，部分患者可通過手術(shù)治療的方法得以控制，但目前對于膀胱癌患者預(yù)后復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高的問題依然缺少高效的控制方法[1]。研究[2]表明，精子相關(guān)抗原9(sperm associated antigen 9, SPAG9)在正常機體曲細(xì)精管的精子中特異性表達(dá)。研究[3-5]顯示，在乳腺癌、宮頸癌、肺癌等組織或血清中表達(dá)量均異常，表明SPAG9參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但SPAG9在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)量以及具體作用機制的相關(guān)研究較為少見。該研究通過檢測SPAG9在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)狀況，分析沉默SPAG9在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，為其膀胱癌的診斷和臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人膀胱癌細(xì)胞系T24、J28、RT4以及人膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1均購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。

1.1.2實驗主要試劑及儀器 McCoy’s 5A培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、F12K培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；β肌動蛋白(β-actin)抗體、SPAG9抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)凋亡檢測試劑盒、Matrigel膠購自美國BD公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗體購自美國Sigma公司；增殖細(xì)胞核抗原(poliferating cell nucler antigen, PCNA)抗體、細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki-67(nuclear associated antigen Ki67, Ki-67)抗體購自Cellular Signaling Technology公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrixmetalloprotease 2, MMP-2)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloprotease 9, MMP-9)抗體購自武漢博士德公司;熒光定量PCR儀(LightCycler? 480)購自美國Roche公司；凝膠成像系統(tǒng)(Syngene G:BOX)購自英國SynGene公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng) 膀胱癌T24、J28細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，RT4細(xì)胞置于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基中，膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1置于F12K培養(yǎng)基中，均放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，收集對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測細(xì)胞中SPAG9 mRNA的表達(dá)量 SPAG9引物在Primer 5.0軟件中進(jìn)行設(shè)計并由上海生工合成，見表1。每孔細(xì)胞中加入1 ml TRIzol并置于冰上5 min，提取細(xì)胞中總RNA。吸取5 μg細(xì)胞總RNA，65 ℃變性10 min，冰浴2 min，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，保存于-20 ℃。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq試劑盒所示，以cDNA為模板，以β-actin為參照反應(yīng)條件為94 ℃、 4 min，94 ℃、 30 s，56 ℃ 、30 s，72 ℃、 30 s，40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，2-ΔΔCt法計算SPAG9的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.3Western blot法檢測SPAG9蛋白的表達(dá)水平 棄去培養(yǎng)基，加入蛋白裂解液，冰浴5 min，離心，收集上清液，吸取2 μl進(jìn)行濃度測定，其余蛋白樣品與適量5×上樣緩沖液混合均勻，煮沸5 min；配置適宜濃度的分離膠，吸取40 μg蛋白樣品加入上樣孔中，恒壓為80 V，電泳至蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠，調(diào)整為恒壓120 V，電泳至蛋白遷移至分離膠底部；恒定電流300 mA轉(zhuǎn)膜150 min；將PVDF膜浸泡與5%的奶粉溶液中，室溫孵育2 h；加入一抗工作液，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10 min，加入二抗，37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，避光，加入ECL發(fā)光液，凝膠成像儀中檢測，分析蛋白質(zhì)灰度值。

1.2.4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 以膀胱癌T24細(xì)胞作為后續(xù)實驗研究對象，穩(wěn)定傳代后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將膀胱癌T24細(xì)胞分為3組：對照組、轉(zhuǎn)染無義組、siRNA-SPAG9組。轉(zhuǎn)染前24 h，每孔接種3×105個細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前6 h更換為無血清培養(yǎng)基。分別將siRNA和Lipofectamine 2000溶于無血清培養(yǎng)基中，然后混合均勻，室溫孵育10 min，形成復(fù)合物；每孔細(xì)胞中加入上述復(fù)合物，37 ℃培養(yǎng)6 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中SPAG9 的表達(dá)量。

1.2.5MTT檢測細(xì)胞的增殖 以每孔5×103個接種，轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入100 μl DMSO，避光振蕩20 min，檢測細(xì)胞在490 nm的吸光值(A490 nm)。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率 取轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，無菌磷酸鹽緩沖液清洗，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，加入100 μl 1×緩沖液，每孔加入5 μl Annexin V-FITC混勻，室溫孵育15 min，每孔加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide, PI)，流式細(xì)胞儀檢測凋亡的細(xì)胞，計算細(xì)胞總的凋亡率。

1.2.7細(xì)胞的遷移、侵襲實驗 收集各組細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整為1×105個/ml；將Transwell小室置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，吸取200 μl細(xì)胞懸液加入上層上室內(nèi)，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；棄去上層培養(yǎng)基，擦去上層細(xì)胞、Matrigel膠，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機取5個區(qū)域拍照、計數(shù)，每孔設(shè)置5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，取平均值。在侵襲實驗過程中，按1 ∶8的比例將Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基混勻，取80 μl均勻覆蓋在小室膜中，其余實驗步驟同遷移實驗。

1.2.8Western blot檢測細(xì)胞惡性表型相關(guān)蛋白的水平 根據(jù)1.2.3所示，檢測各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、PCAN、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的水平。

2 結(jié)果

2.1SPAG9在膀胱癌以及正常上皮細(xì)胞中的表達(dá)量SV-HUC-1細(xì)胞和膀胱癌T24細(xì)胞、J28細(xì)胞、RT4細(xì)胞的SPAG9 mRNA和蛋白的表達(dá)量整體比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=63.639,P=0.000;F=73.581,P=0.000)。SPAG9 mRNA的表達(dá)量分別為(1.000±0.023)、(6.589±0.741)、(4.865±0.520)、(4.573±0.467)，蛋白的表達(dá)量分別為(0.158±0.012)、(0.769±0.068)、(0.524±0.053)、(0.489±0.052)；結(jié)果如圖1所示，qRT-PCR實驗結(jié)果表明，與膀胱上皮SV-HUC-1細(xì)胞比較，SPAG9 mRNA在膀胱癌T24、J28、RT4細(xì)胞中的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與T24細(xì)胞比較，SPAG9 mRNA在J28、RT4細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。Western blot實驗結(jié)果亦顯示，SPAG9蛋白在膀胱癌T24、J28、RT4細(xì)胞中的相對表達(dá)量較SV-HUC-1細(xì)胞顯著增加(P<0.05)；與T24細(xì)胞比較，SPAG9蛋白在J28、RT4細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞中SPAG9的表達(dá)量結(jié)果如圖2所示，對照組、轉(zhuǎn)染無義組、siRNA-SPAG9組細(xì)胞中SPAG9 mRNA、蛋白質(zhì)水平整體比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=271.950,P=0.000;F=92.969,P=0.000)。對照組、轉(zhuǎn)染無義組、siRNA-SPAG9組細(xì)胞中SPAG9 mRNA的表達(dá)量分別為(1.003±0.024)、(1.000±0.016)、(0.427±0.053)，SPAG9蛋白水平分別為(0.813±0.074)、(0.798±0.062)、(0.254±0.023)。轉(zhuǎn)染后，T24細(xì)胞中SPAG9 mRNA和蛋白的表達(dá)量較對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 SPAG9在膀胱癌以及正常上皮細(xì)胞中的表達(dá)量

與SV-HUC-1細(xì)胞比較：*P<0.05；與T24細(xì)胞比較：#P<0.05

圖2 轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞中SPAG9的表達(dá)量

2.3沉默SPAG9對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響結(jié)果如圖3所示，對照組、轉(zhuǎn)染無義組、siRNA-SPAG9組細(xì)胞在490 nm波長下的吸光值分別為(1.236±0.214)、(1.258±0.223)、(0.567±0.053)。3組細(xì)胞在490 nm波長下的吸光值整體比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.118,P=0.005)；轉(zhuǎn)染后，T24細(xì)胞的增殖較對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4沉默SPAG9對膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果如圖4所示，對照組、轉(zhuǎn)染無義組、siRNA-SPAG9組細(xì)胞的凋亡率分別為(6.521±0.784)%、(5.872±0.736)%、(17.489±2.553)%。3組細(xì)胞的凋亡率整體比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.974,P=0.000)；轉(zhuǎn)染siRNA-SPAG9后，T24細(xì)胞的凋亡率較對照組顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 沉默SPAG9 對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響

2.5沉默SPAG9對膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響結(jié)果如圖5所示，對照組、轉(zhuǎn)染無義組、siRNA-SPAG9組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(369.587±23.786)個、(374.586±25.598)個、(153.226±12.147)個；侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(169.557±18.456)個、(158.236±16.745)個、(82.451±9.227)個。3組的遷移細(xì)胞和侵襲細(xì)胞數(shù)分別整體比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=105.040,P=0.000;F=28.589,P=0.001)；轉(zhuǎn)染siRNA-SPAG9后，T24細(xì)胞的侵襲、遷移能力較對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6沉默SPAG9對膀胱癌細(xì)胞惡性表型相關(guān)蛋白水平的影響結(jié)果如圖6、表2所示，以β-actin為參照，對照組、轉(zhuǎn)染無義組、siRNA-SPAG9組細(xì)胞惡性表型相關(guān)蛋白具有顯著變化。與對照組比較，siRNA-SPAG9組細(xì)胞中PCAN、Ki67、Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Bax蛋白顯著上調(diào)(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白顯著下調(diào)(P<0.05)。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，在我國，膀胱癌的發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，其中男性的發(fā)病率高于女性[6]。膀胱癌術(shù)后易發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年存活率較低，預(yù)后較差，治療費用較高，給患者以及社會帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前，尋找膀胱癌治療的分子靶向標(biāo)志物，使其服務(wù)于膀胱癌的診斷以及臨床治療具有重要的意義。SPAG9是目前新發(fā)現(xiàn)的腫瘤睪丸抗原之一，調(diào)控腫瘤癌基因的水平以及細(xì)胞的擴增等。早期人們認(rèn)為SPAG9只特異性表達(dá)于睪丸組織中，不表達(dá)于正常組織，調(diào)控精卵結(jié)合的過程。但近年來的研究[7-9]顯示，SPAG9在腫瘤組織或者血清中發(fā)揮較強的免疫原性作用。SPAG9通過與多種細(xì)胞因子以及蛋白結(jié)合，從而激活細(xì)胞中的信號通路，調(diào)控人體多種生理過程，與機體某些疾病和腫瘤的演進(jìn)密切相關(guān)，因此SPAG9可能是腫瘤生物治療的潛在靶點[10-13]。以人膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1和膀胱癌T24、J28、RT4細(xì)胞系作為體外實驗的研究對象，qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，SPAG9在膀胱癌T24、J28、RT4細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著高于膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1，提示SPAG9在膀胱癌的差異表達(dá)與膀胱癌細(xì)胞的惡化過程密切相關(guān)。

圖4 沉默SPAG9 對膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響

蛋白對照組轉(zhuǎn)染無義組siRNA-SPAG9組F值P值PCAN0.541±0.0470.568±0.0500.236±0.018?60.7920.010Ki-670.478±0.0390.486±0.0430.216±0.025?53.1700.012Bcl-20.685±0.0630.679±0.0580.241±0.032?69.8250.015Bax0.257±0.0210.263±0.0270.692±0.057?126.7150.008MMP-20.258±0.0260.274±0.0230.124±0.017?40.8760.018MMP-90.341±0.030.336±0.0350.154±0.012?42.6980.009

與對照組比較：*P<0.05

圖5 沉默SPAG9 對膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響

圖6 沉默SPAG9 對膀胱癌細(xì)胞惡性表型相關(guān)蛋白水平的影響

大量研究顯示，探究腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤的機制，尋找合適的分子靶點，對提高腫瘤患者的5年生存率以及改善預(yù)后不良、降低治療費用具有重要的意義。腫瘤細(xì)胞的過度增殖是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要生物學(xué)特征。腫瘤細(xì)胞的增殖涉及多種信號因子或者相關(guān)信號通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。SPAG9在多種腫瘤的惡性發(fā)展中發(fā)揮重要作用。應(yīng)用siRNA技術(shù)，沉默膀胱癌T24細(xì)胞中SPAG9的表達(dá)后，T24細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，凋亡率顯著增加，細(xì)胞的侵襲、遷移能力顯著降低，表明SPAG9在膀胱癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性中發(fā)揮重要作用。

大量研究[14]表明，SPAG9與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移密切相關(guān)。SPAG9在肺癌組織以及血清中的表達(dá)量異常，可作為肺癌診斷的分子標(biāo)志物。SPAG9可通過降低MMP-9、激活相關(guān)信號通路，從而調(diào)節(jié)肺癌的轉(zhuǎn)移能力;在前列腺癌中，SPAG9可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E水平，從而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抗腫瘤作用[15]。為了研究SPAG9對膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)特性的作用機制，對細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及侵襲遷移相關(guān)蛋白PCAN、Ki-67、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9等進(jìn)行了檢測，分析沉默SPAG9后，上述蛋白水平的變化。結(jié)果顯示，下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中SPAG9基因的表達(dá)量，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCAN、Ki-67的表達(dá)量降低；與對照組比較，細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著降低，促凋亡蛋白Bax的水平明顯增加；細(xì)胞侵襲、遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)量較對照組顯著下調(diào)，表明SPAG9可能通過調(diào)控細(xì)胞惡性表型相關(guān)蛋白，從而激活更多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮其抗腫瘤的作用。

綜上所述，研究顯示，SPAG9在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)量上調(diào)，表明SPAG9與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；沉默SPAG9可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞惡性表型相關(guān)蛋白的表達(dá)量，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，降低細(xì)胞的侵襲、遷移能力，可作為膀胱癌診斷和預(yù)后評估的生物學(xué)標(biāo)志以及分子靶向治療的潛在靶點。