阮曉佳，郜玉鋼*，趙 巖，臧 埔，何忠梅，祝洪艷，王立巖，張連學(xué)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118）

人參（Panax ginseng C.A. Mey.）是五加科人參屬植物人參的干燥根，主要包括林下參、園參、農(nóng)田參3 種栽培類型[1-2]，人參是百草之王，具有多種藥理作用[3-4]。近年來隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強(qiáng)，人參的需求量不斷增加，特別是林下參更是供不應(yīng)求，但由于國家天寶工程的實施，伐林栽參已被明令禁止，導(dǎo)致園參的栽培數(shù)量急劇下降[5]。除農(nóng)田栽參外，主要發(fā)展林下參種植以解決供求矛盾，但農(nóng)田栽參技術(shù)尚未完全成熟，林下參種植面積迅速增加[6]。生態(tài)環(huán)境是影響林下參質(zhì)量的主要條件，對人參藥效成分的含量與生長發(fā)育具有重要的作用。將環(huán)境因子控制在最適宜的范圍內(nèi)，能夠有效提高人參的品質(zhì)，為人參生產(chǎn)條件的改善提供理論依據(jù)，從而使人參資源得到更加合理的開發(fā)與利用[7]。

人參皂苷是人參主要活性成分，人參皂苷種類和含量是評價人參質(zhì)量的重要指標(biāo)，找到其影響因素至關(guān)重要。目前，生態(tài)環(huán)境與人參質(zhì)量之間的關(guān)系已成為研究熱點[8-9]?，F(xiàn)已有報道，產(chǎn)地、參齡、海拔、光照及土壤等因素均會對人參皂苷含量有一定程度的影響[10-13]。但這些研究多集中在園參上，且評價產(chǎn)地范圍較小和皂苷種類較少。林下參在何地種植、何種環(huán)境下種植、何時進(jìn)行采收才能質(zhì)量最佳尚無定論，特別是林型結(jié)構(gòu)對林下參質(zhì)量的影響鮮見報道。因此通過不同林型、產(chǎn)地、參齡及坡向?qū)α窒聟?0 種單體皂苷含量影響的研究，不僅對林下參的采收和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定具有重要的實踐價值，還能夠為退耕還林時種植何種樹種及其環(huán)境條件的選擇提供理論指導(dǎo)，從而提升林下參皂苷含量與藥用價值，也為林下參資源可持續(xù)開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試林下參分別采集于吉林省的榆林鎮(zhèn)、靖宇縣、撫松縣，遼寧省的桓仁縣、新賓縣和黑龍江省的雙鴨山市的不同坡向的樟子松林、闊葉松林、落葉松林以及針闊混交林下，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院郜玉鋼教授鑒定分別為5、10 a和15 a林下參。

對照品人參皂苷Rg1、Re、Rg2、Rg3、Rg5、Rf、F1、F2、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Rh2、Compound K、20(R)Rh1、Rk3、Rh4、原人參二醇及原人參三醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98%以上，批號分別為201511、201523、201545、201506、201524、201537、201549、201521、201536、201579、201501、201551、201518、201543、201520、201515、201562、201571、201519、201513 吉林大學(xué)天然藥物化學(xué)實驗室；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；純凈水杭州娃哈哈公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010A高效液相色譜儀（配有LC-2010A型液相色譜泵、LC-2010A型自動進(jìn)樣器、CLASS-VP色譜工作站）、AUY220電子分析天平 日本島津公司；KQ-250DV超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設(shè)計與樣品溶液制備

林型、產(chǎn)地、參齡及坡向?qū)α窒聟⒃碥沼绊懢捎脝我蛩卦囼炘O(shè)計，4 種林型組林下參分別采集于吉林省靖宇縣陰坡下樟子松林、闊葉林、落葉松林以及針闊混交林的15 a生林下參，每組9 株；6 個產(chǎn)地組林下參分別采集于吉林省的榆林鎮(zhèn)、靖宇縣、撫松縣，遼寧省的桓仁縣、新賓縣和黑龍江省雙鴨山市的針闊混交林陰坡下10 a生林下參，每組9 株；3 種參齡組林下參分別采集于吉林省靖宇縣針闊混交林陰坡下的5、10 a和15 a生林下參，每組9 株；3 種坡向組林下參分別采集于吉林省靖宇縣針闊混交林的陽坡、平坡、陰坡下10 a生林下參，每組9 株；樣品均為隨機(jī)采集，均在9—10月相同時間進(jìn)行。將每組林下參樣品均置于通風(fēng)處陰干后，單株粉碎成粒度為40 目粉末，單株混勻后，再分別精密稱取其粉末0.5 g；各樣品分別置于10 mL離心管中，向其中分別加入5.0 mL色譜甲醇溶液，密封，稱質(zhì)量，超聲提取45 min，靜置過夜，補(bǔ)足質(zhì)量，再進(jìn)行超聲45 min，5 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，備用。

1.3.2 高效液相色譜測定20 種人參皂苷

色譜條件參照本實驗室建立的高效液相色譜同時測定20 種人參皂苷的方法[14]。C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；檢測波長203 nm；流動相A為乙腈，流動相B為水；梯度洗脫：0～40 min，18%～21% A；40～42 min，21%～26% A；42～46 min，26%～32% A；46～66 min，32%～33.8% A；66～71 min，33.8%～38% A；71～77.7 min，38%～49.08% A；77.7～78 min，49.08%～49.1% A；78～82 min，49.1% A；82～83 min，49.1%～50.6% A；83～88 min，50.6%～59.6% A；88～89.8 min，59.6%～64.96% A；89.8～92 min，64.96%～65% A；92～97 min，65% A；97～102 min，65%～85% A；102～109 min，85% A；109～111 min，85%～18% A；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 20 種人參單體皂苷對照品測定結(jié)果

2.1.1 色譜峰歸屬

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed standard solution

如圖1所示，20 種人參皂苷單體均得到良好分離。

2.1.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

表1 人參皂苷的回歸方程Table 1 Regression equations with correlation coefficients for ginsenosides

對進(jìn)樣中人參皂苷質(zhì)量（Y）對峰面積積分值（X）作圖，得到線性回歸方程，如表1所示。20 種人參皂苷單體Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rk3、F2、Rh4、Rg3、原人參三醇、Compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇在1.96～20.80 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＞0.999，n=6）。

2.2 不同林型林下參皂苷含量變化

圖2 林型對林下參皂苷含量影響色譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms showing the effects of different forest types on contents of ginsenosides in ginseng roots

不同林型林下參均含有14 種人參皂苷單體，如圖2、表2所示。Rg1、Rf含量及20 種單體皂苷加和值樟子松林組顯著高于其他3 種林型（P＜0.05）；Re、Rb2、Rb3含量樟子松林組顯著高于落葉松林組與闊葉林組（P＜0.05），針闊混交林組與其余各組間差異均不顯著（P＞0.05）；Rb1含量樟子松林組顯著高于其他3 種林型（P＜0.05），針闊混交林組、闊葉林組顯著高于落葉松林組（P＜0.05）；Rg2含量落葉松林組顯著高于其他3 種林型（P＜0.05）；Rd含量針闊混交林組、樟子松林組顯著高于其他2 組（P＜0.05）；Rh4含量落葉松林組顯著高于針闊混交林組（P＜0.05），闊葉林組、樟子松林組與各組間差異均不顯著（P＞0.05）；人參皂苷Rg5含量樟子松林組、闊葉松林組顯著高于其他2 組（P＜0.05）?？梢?，樟子松林型下林下參中多種皂苷含量較高，在實際栽培與應(yīng)用中，應(yīng)優(yōu)先選擇在樟子松林種植林下參。

表2 林型對林下參皂苷含量的影響Table 2 Effects of different forest types on contents of ginsenosides in ginseng roots %

2.3 不同產(chǎn)地林下參皂苷含量變化

圖3 產(chǎn)地對林下參皂苷含量影響色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms showing the effects of different producing areas on contents of ginsenosidet in in ginseng roots

不同產(chǎn)地林下參均含有14 種人參皂苷單體，如圖3、表3所示。Rg1含量撫松縣露水河鎮(zhèn)顯著高于靖宇縣燕平鄉(xiāng)、新賓縣倒木溝村、榆林鎮(zhèn)白興村、桓仁縣大東溝村（P＜0.05），黑龍江雙鴨山與其余各組間差異不顯著（P＞0.05）；Rf含量撫松縣露水河鎮(zhèn)顯著高于靖宇縣燕平鄉(xiāng)、新賓縣倒木溝村與榆林鎮(zhèn)白興村（P＜0.05），黑龍江雙鴨山顯著高于榆林鎮(zhèn)白興村（P＜0.05），桓仁縣大東溝村與各組間均無顯著性差異（P＞0.05）；Rh4含量新賓縣倒木溝村、榆林鎮(zhèn)白興村、桓仁縣大東溝村顯著高于撫松縣露水河鎮(zhèn)（P＜0.05），黑龍江雙鴨山、靖宇縣燕平鄉(xiāng)與各組間均無顯著性差異（P＞0.05）；原人參二醇含量新賓縣倒木溝村、榆林鎮(zhèn)白興村、桓仁縣大東溝村顯著高于其他3 個產(chǎn)地（P＜0.05）。20 種人參單體皂苷加和值及其他單體皂苷均無顯著性差異（P＞0.05）?？梢?，撫松縣露水河鎮(zhèn)皂苷含量較高，可根據(jù)實際情況對林下參的種植地域進(jìn)行選擇。

表3 產(chǎn)地對林下參皂苷含量的影響Table 3 Effects of different producing areas on contents of ginsenosides in ginseng roots %

2.4 不同參齡林下參皂苷含量變化

不同參齡林下參均含有14 種人參皂苷單體，如圖4、表4所示。Rg1含量15、10 a生顯著高于5 a生（P＜0.05）；Rf含量15 a生顯著高于5 a生（P＜0.05），10 a生與各組間差異不顯著（P＞0.05）；Rb1含量15 a生顯著高于10、5 a生（P＜0.05）；而Compound K含量5 a生均顯著高于10、15 a生（P＜0.05）；原人參二醇含量5 a生顯著高于15 a生，10 a生與各組間均不顯著。但20 種人參皂苷單體加和值及其他各單體皂苷均無顯著性差異（P＞0.05）?？梢?，以人參皂苷含量為依據(jù)，15、10、5 a生林下參皂苷含量均符合藥典規(guī)定，可以采收應(yīng)用，僅取單體皂苷原人參二醇、Compound K以5 a生進(jìn)行采收最佳。

圖4 參齡對林下參皂苷含量影響色譜圖Fig. 4 HPLC chromatograms showing the effects of different ages on contents of ginsenosidet in ginseng roots

表4 參齡對林下參皂苷含量的影響Table 4 Effects of different ages on contents of ginsenosides in ginseng roots %

2.5 不同坡向林下參皂苷含量變化

不同坡向林下參均含有14 種人參皂苷皂苷單體，如圖5、表5所示。Rb2含量陽坡顯著高于平坡與陰坡（P＜0.05），而陰坡顯著高于平坡（P＜0.05）；Rb3含量陽坡與陰坡顯著高于平坡（P＜0.05）；Rh2含量陰坡顯著高于陽坡（P＜0.05），但與平坡并無顯著性差異；20 種人參單體皂苷加和值及其他單體均無顯著性差異（P＞0.05）?？梢?，坡向?qū)? 種皂苷單體含量有顯著影響，可根據(jù)實際需求對林下參栽培坡向進(jìn)行選擇。

圖5 坡向?qū)α窒聟⒃碥蘸坑绊懮V圖Fig. 5 HPLC chromatograms showing the effects of different slope orientations on contents of ginsenosidet in ginseng roots

表5 坡向?qū)α窒聟⒃碥蘸康挠绊慣able 5 Effects of different slope orientations on contents of ginsenosides in ginseng roots %

2.6 林下參皂苷含量變化影響因素的主成分分析

表6 林下參皂苷含量變化因素的主成分分析Table 6 Principal component analysis of causative factors for changes in ginsenosides contents in ginseng roots

表7 各指標(biāo)主成分的特征向量Table 7 Eigenvectors of principal components

根據(jù)特征值可確定主成分，見表6。第1主成分的特征值是3.962 7，貢獻(xiàn)率已達(dá)99.068 6%。即第1主成分可代表林下參皂苷含量變化影響因素99.068 6%的信息含量。林型、產(chǎn)地、參齡以及坡向在第1主成分上均有較高的負(fù)荷，如表7所示，說明林型、產(chǎn)地、參齡以及坡向均是影響林下參皂苷含量變化的特征因素。

2.7 林下參特征皂苷的主成分分析

表8 林下參皂苷評價標(biāo)準(zhǔn)的主成分分析Table 8 Principal component analysis of ginsenosides for quality criteria of ginseng roots

表9 各指標(biāo)主成分的特征向量Table 9 Eigenvectors of principal components

根據(jù)特征值可確定主成分個數(shù)，見表8。第1主成分的特征值是11.335 4，累計貢獻(xiàn)率為75.569 4%，第2主分的特征值是2.765 2，累計貢獻(xiàn)率已達(dá)94.004 3%。即2 個主成分可代表林下參皂苷94.004 3%的信息含量。Re、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg5、原人參二醇以及總皂苷加和值在第1主成分上有較高的負(fù)荷，而Rg1、Rb1、Rh4在第2主成分上有較高的負(fù)荷，如表9所示。說明10 種單體皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh4、Rg5、原人參二醇以及總皂苷加和值等元素均是評價林下參質(zhì)量的特征皂苷。

3 討 論

人參具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤及促進(jìn)代謝等多種藥理活性，人參皂苷是評價人參質(zhì)量的重要指標(biāo)[15-19]。本實驗通過研究林型、產(chǎn)地、參齡及坡向?qū)α窒聟⒃碥蘸康挠绊懀_定何種條件更有利于獲得優(yōu)質(zhì)林下參，進(jìn)而為林下參的種植和采收及應(yīng)用提供依據(jù)[20-22]。長白山區(qū)主要分布的林型包括針葉林、針闊混交林、樟子松林與落葉松林等，因此本實驗選擇了幾種有代表性的林型下種植的林下參為研究對象，本研究發(fā)現(xiàn)林型對林下參皂苷含量有顯著影響，樟子松林型下林下參皂苷含量較高，質(zhì)量最好，這一結(jié)果不但打破了參農(nóng)們長期形成的樟子松下不能栽培人參的固有觀念，相反樟子松較椴樹等闊葉林更適宜于林下參的種植，在應(yīng)用林下參時應(yīng)作為首選。6 個產(chǎn)地均為林下參道地產(chǎn)區(qū)，多數(shù)單體皂苷含量差異不顯著，但人參單體皂苷Rg1、Rf含量撫松縣露水河鎮(zhèn)林下參最高，可能是因為海拔、積溫、降水量以及光照等因素不同所致，在本實驗范圍內(nèi)撫松縣露水河鎮(zhèn)更適合林下參的種植[23-28]。雖然5～15 a生林下參均達(dá)到文獻(xiàn)[29]要求，但不同年生林下參單體皂苷含量不同，隨參齡的增加Rg1、Rf、Rb1單體皂苷含量提高，而單體皂苷Compound K、原人參二醇含量下降，其次生代謝累計機(jī)理有待于進(jìn)一步研究[30-31]。坡向不同林下參單體皂苷不同，陽坡林下參單體皂苷Rb2、Rb3含量最高，陰坡林下參單體皂苷Rh2含量最高，可能與溫度、光照、通風(fēng)等環(huán)境條件有關(guān)。通過主成分分析可確定，Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh4、Rg5、原人參二醇以及總皂苷加和值等皂苷可作為林下參的特征皂苷，在評價林下參質(zhì)量時，可以此為據(jù)。不同林型、產(chǎn)地、參齡及坡向?qū)α窒聟⑷藚⒃碥諉误w種類沒有顯著影響，均含有14 種人參皂苷單體Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh4、Compound K、Rg5、Rh2及原人參二醇，可能是因為林下參中人參皂苷的種類是由林下參基因所決定的，而不受環(huán)境條件影響，有待于進(jìn)一步驗證。可見，在林下參的種植、采收、利用等環(huán)節(jié)中應(yīng)綜合考慮林型、產(chǎn)地、參齡及坡向的選擇。