阮曉佳,郜玉鋼*,趙 巖,臧 埔,何忠梅,祝洪艷,王立巖,張連學
(吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院,吉林 長春 130118)
人參(Panax ginseng C.A. Mey.)是五加科人參屬植物人參的干燥根,主要包括林下參、園參、農(nóng)田參3 種栽培類型[1-2],人參是百草之王,具有多種藥理作用[3-4]。近年來隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強,人參的需求量不斷增加,特別是林下參更是供不應求,但由于國家天寶工程的實施,伐林栽參已被明令禁止,導致園參的栽培數(shù)量急劇下降[5]。除農(nóng)田栽參外,主要發(fā)展林下參種植以解決供求矛盾,但農(nóng)田栽參技術尚未完全成熟,林下參種植面積迅速增加[6]。生態(tài)環(huán)境是影響林下參質(zhì)量的主要條件,對人參藥效成分的含量與生長發(fā)育具有重要的作用。將環(huán)境因子控制在最適宜的范圍內(nèi),能夠有效提高人參的品質(zhì),為人參生產(chǎn)條件的改善提供理論依據(jù),從而使人參資源得到更加合理的開發(fā)與利用[7]。
人參皂苷是人參主要活性成分,人參皂苷種類和含量是評價人參質(zhì)量的重要指標,找到其影響因素至關重要。目前,生態(tài)環(huán)境與人參質(zhì)量之間的關系已成為研究熱點[8-9]?,F(xiàn)已有報道,產(chǎn)地、參齡、海拔、光照及土壤等因素均會對人參皂苷含量有一定程度的影響[10-13]。但這些研究多集中在園參上,且評價產(chǎn)地范圍較小和皂苷種類較少。林下參在何地種植、何種環(huán)境下種植、何時進行采收才能質(zhì)量最佳尚無定論,特別是林型結構對林下參質(zhì)量的影響鮮見報道。因此通過不同林型、產(chǎn)地、參齡及坡向?qū)α窒聟?0 種單體皂苷含量影響的研究,不僅對林下參的采收和質(zhì)量標準制定具有重要的實踐價值,還能夠為退耕還林時種植何種樹種及其環(huán)境條件的選擇提供理論指導,從而提升林下參皂苷含量與藥用價值,也為林下參資源可持續(xù)開發(fā)利用提供科學依據(jù)。
供試林下參分別采集于吉林省的榆林鎮(zhèn)、靖宇縣、撫松縣,遼寧省的桓仁縣、新賓縣和黑龍江省的雙鴨山市的不同坡向的樟子松林、闊葉松林、落葉松林以及針闊混交林下,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院郜玉鋼教授鑒定分別為5、10 a和15 a林下參。
對照品人參皂苷Rg1、Re、Rg2、Rg3、Rg5、Rf、F1、F2、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Rh2、Compound K、20(R)Rh1、Rk3、Rh4、原人參二醇及原人參三醇質(zhì)量分數(shù)均在98%以上,批號分別為201511、201523、201545、201506、201524、201537、201549、201521、201536、201579、201501、201551、201518、201543、201520、201515、201562、201571、201519、201513 吉林大學天然藥物化學實驗室;甲醇、乙腈(均為色譜純) 美國Fisher Scientific公司;純凈水杭州娃哈哈公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
LC-2010A高效液相色譜儀(配有LC-2010A型液相色譜泵、LC-2010A型自動進樣器、CLASS-VP色譜工作站)、AUY220電子分析天平 日本島津公司;KQ-250DV超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司。
1.3.1 實驗設計與樣品溶液制備
林型、產(chǎn)地、參齡及坡向?qū)α窒聟⒃碥沼绊懢捎脝我蛩卦囼炘O計,4 種林型組林下參分別采集于吉林省靖宇縣陰坡下樟子松林、闊葉林、落葉松林以及針闊混交林的15 a生林下參,每組9 株;6 個產(chǎn)地組林下參分別采集于吉林省的榆林鎮(zhèn)、靖宇縣、撫松縣,遼寧省的桓仁縣、新賓縣和黑龍江省雙鴨山市的針闊混交林陰坡下10 a生林下參,每組9 株;3 種參齡組林下參分別采集于吉林省靖宇縣針闊混交林陰坡下的5、10 a和15 a生林下參,每組9 株;3 種坡向組林下參分別采集于吉林省靖宇縣針闊混交林的陽坡、平坡、陰坡下10 a生林下參,每組9 株;樣品均為隨機采集,均在9—10月相同時間進行。將每組林下參樣品均置于通風處陰干后,單株粉碎成粒度為40 目粉末,單株混勻后,再分別精密稱取其粉末0.5 g;各樣品分別置于10 mL離心管中,向其中分別加入5.0 mL色譜甲醇溶液,密封,稱質(zhì)量,超聲提取45 min,靜置過夜,補足質(zhì)量,再進行超聲45 min,5 000 r/min離心15 min,取上清液過0.45 μm濾膜,備用。
1.3.2 高效液相色譜測定20 種人參皂苷
色譜條件參照本實驗室建立的高效液相色譜同時測定20 種人參皂苷的方法[14]。C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫35 ℃;檢測波長203 nm;流動相A為乙腈,流動相B為水;梯度洗脫:0~40 min,18%~21% A;40~42 min,21%~26% A;42~46 min,26%~32% A;46~66 min,32%~33.8% A;66~71 min,33.8%~38% A;71~77.7 min,38%~49.08% A;77.7~78 min,49.08%~49.1% A;78~82 min,49.1% A;82~83 min,49.1%~50.6% A;83~88 min,50.6%~59.6% A;88~89.8 min,59.6%~64.96% A;89.8~92 min,64.96%~65% A;92~97 min,65% A;97~102 min,65%~85% A;102~109 min,85% A;109~111 min,85%~18% A;流速1.0 mL/min;進樣量20 μL。
所得數(shù)據(jù)應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,以±s表示。
2.1.1 色譜峰歸屬
圖1 混合標準品色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed standard solution
如圖1所示,20 種人參皂苷單體均得到良好分離。
2.1.2 線性關系考察結果
表1 人參皂苷的回歸方程Table 1 Regression equations with correlation coefficients for ginsenosides
對進樣中人參皂苷質(zhì)量(Y)對峰面積積分值(X)作圖,得到線性回歸方程,如表1所示。20 種人參皂苷單體Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rk3、F2、Rh4、Rg3、原人參三醇、Compound K、Rg5、Rh2、原人參二醇在1.96~20.80 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系(r>0.999,n=6)。
圖2 林型對林下參皂苷含量影響色譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms showing the effects of different forest types on contents of ginsenosides in ginseng roots
不同林型林下參均含有14 種人參皂苷單體,如圖2、表2所示。Rg1、Rf含量及20 種單體皂苷加和值樟子松林組顯著高于其他3 種林型(P<0.05);Re、Rb2、Rb3含量樟子松林組顯著高于落葉松林組與闊葉林組(P<0.05),針闊混交林組與其余各組間差異均不顯著(P>0.05);Rb1含量樟子松林組顯著高于其他3 種林型(P<0.05),針闊混交林組、闊葉林組顯著高于落葉松林組(P<0.05);Rg2含量落葉松林組顯著高于其他3 種林型(P<0.05);Rd含量針闊混交林組、樟子松林組顯著高于其他2 組(P<0.05);Rh4含量落葉松林組顯著高于針闊混交林組(P<0.05),闊葉林組、樟子松林組與各組間差異均不顯著(P>0.05);人參皂苷Rg5含量樟子松林組、闊葉松林組顯著高于其他2 組(P<0.05)??梢?,樟子松林型下林下參中多種皂苷含量較高,在實際栽培與應用中,應優(yōu)先選擇在樟子松林種植林下參。
表2 林型對林下參皂苷含量的影響Table 2 Effects of different forest types on contents of ginsenosides in ginseng roots %
圖3 產(chǎn)地對林下參皂苷含量影響色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms showing the effects of different producing areas on contents of ginsenosidet in in ginseng roots
不同產(chǎn)地林下參均含有14 種人參皂苷單體,如圖3、表3所示。Rg1含量撫松縣露水河鎮(zhèn)顯著高于靖宇縣燕平鄉(xiāng)、新賓縣倒木溝村、榆林鎮(zhèn)白興村、桓仁縣大東溝村(P<0.05),黑龍江雙鴨山與其余各組間差異不顯著(P>0.05);Rf含量撫松縣露水河鎮(zhèn)顯著高于靖宇縣燕平鄉(xiāng)、新賓縣倒木溝村與榆林鎮(zhèn)白興村(P<0.05),黑龍江雙鴨山顯著高于榆林鎮(zhèn)白興村(P<0.05),桓仁縣大東溝村與各組間均無顯著性差異(P>0.05);Rh4含量新賓縣倒木溝村、榆林鎮(zhèn)白興村、桓仁縣大東溝村顯著高于撫松縣露水河鎮(zhèn)(P<0.05),黑龍江雙鴨山、靖宇縣燕平鄉(xiāng)與各組間均無顯著性差異(P>0.05);原人參二醇含量新賓縣倒木溝村、榆林鎮(zhèn)白興村、桓仁縣大東溝村顯著高于其他3 個產(chǎn)地(P<0.05)。20 種人參單體皂苷加和值及其他單體皂苷均無顯著性差異(P>0.05)??梢姡瑩崴煽h露水河鎮(zhèn)皂苷含量較高,可根據(jù)實際情況對林下參的種植地域進行選擇。
表3 產(chǎn)地對林下參皂苷含量的影響Table 3 Effects of different producing areas on contents of ginsenosides in ginseng roots %
不同參齡林下參均含有14 種人參皂苷單體,如圖4、表4所示。Rg1含量15、10 a生顯著高于5 a生(P<0.05);Rf含量15 a生顯著高于5 a生(P<0.05),10 a生與各組間差異不顯著(P>0.05);Rb1含量15 a生顯著高于10、5 a生(P<0.05);而Compound K含量5 a生均顯著高于10、15 a生(P<0.05);原人參二醇含量5 a生顯著高于15 a生,10 a生與各組間均不顯著。但20 種人參皂苷單體加和值及其他各單體皂苷均無顯著性差異(P>0.05)。可見,以人參皂苷含量為依據(jù),15、10、5 a生林下參皂苷含量均符合藥典規(guī)定,可以采收應用,僅取單體皂苷原人參二醇、Compound K以5 a生進行采收最佳。
圖4 參齡對林下參皂苷含量影響色譜圖Fig. 4 HPLC chromatograms showing the effects of different ages on contents of ginsenosidet in ginseng roots
表4 參齡對林下參皂苷含量的影響Table 4 Effects of different ages on contents of ginsenosides in ginseng roots %
不同坡向林下參均含有14 種人參皂苷皂苷單體,如圖5、表5所示。Rb2含量陽坡顯著高于平坡與陰坡(P<0.05),而陰坡顯著高于平坡(P<0.05);Rb3含量陽坡與陰坡顯著高于平坡(P<0.05);Rh2含量陰坡顯著高于陽坡(P<0.05),但與平坡并無顯著性差異;20 種人參單體皂苷加和值及其他單體均無顯著性差異(P>0.05)??梢?,坡向?qū)? 種皂苷單體含量有顯著影響,可根據(jù)實際需求對林下參栽培坡向進行選擇。
圖5 坡向?qū)α窒聟⒃碥蘸坑绊懮V圖Fig. 5 HPLC chromatograms showing the effects of different slope orientations on contents of ginsenosidet in ginseng roots
表5 坡向?qū)α窒聟⒃碥蘸康挠绊慣able 5 Effects of different slope orientations on contents of ginsenosides in ginseng roots %
表6 林下參皂苷含量變化因素的主成分分析Table 6 Principal component analysis of causative factors for changes in ginsenosides contents in ginseng roots
表7 各指標主成分的特征向量Table 7 Eigenvectors of principal components
根據(jù)特征值可確定主成分,見表6。第1主成分的特征值是3.962 7,貢獻率已達99.068 6%。即第1主成分可代表林下參皂苷含量變化影響因素99.068 6%的信息含量。林型、產(chǎn)地、參齡以及坡向在第1主成分上均有較高的負荷,如表7所示,說明林型、產(chǎn)地、參齡以及坡向均是影響林下參皂苷含量變化的特征因素。
表8 林下參皂苷評價標準的主成分分析Table 8 Principal component analysis of ginsenosides for quality criteria of ginseng roots
表9 各指標主成分的特征向量Table 9 Eigenvectors of principal components
根據(jù)特征值可確定主成分個數(shù),見表8。第1主成分的特征值是11.335 4,累計貢獻率為75.569 4%,第2主分的特征值是2.765 2,累計貢獻率已達94.004 3%。即2 個主成分可代表林下參皂苷94.004 3%的信息含量。Re、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg5、原人參二醇以及總皂苷加和值在第1主成分上有較高的負荷,而Rg1、Rb1、Rh4在第2主成分上有較高的負荷,如表9所示。說明10 種單體皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh4、Rg5、原人參二醇以及總皂苷加和值等元素均是評價林下參質(zhì)量的特征皂苷。
人參具有抗疲勞、增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤及促進代謝等多種藥理活性,人參皂苷是評價人參質(zhì)量的重要指標[15-19]。本實驗通過研究林型、產(chǎn)地、參齡及坡向?qū)α窒聟⒃碥蘸康挠绊?,確定何種條件更有利于獲得優(yōu)質(zhì)林下參,進而為林下參的種植和采收及應用提供依據(jù)[20-22]。長白山區(qū)主要分布的林型包括針葉林、針闊混交林、樟子松林與落葉松林等,因此本實驗選擇了幾種有代表性的林型下種植的林下參為研究對象,本研究發(fā)現(xiàn)林型對林下參皂苷含量有顯著影響,樟子松林型下林下參皂苷含量較高,質(zhì)量最好,這一結果不但打破了參農(nóng)們長期形成的樟子松下不能栽培人參的固有觀念,相反樟子松較椴樹等闊葉林更適宜于林下參的種植,在應用林下參時應作為首選。6 個產(chǎn)地均為林下參道地產(chǎn)區(qū),多數(shù)單體皂苷含量差異不顯著,但人參單體皂苷Rg1、Rf含量撫松縣露水河鎮(zhèn)林下參最高,可能是因為海拔、積溫、降水量以及光照等因素不同所致,在本實驗范圍內(nèi)撫松縣露水河鎮(zhèn)更適合林下參的種植[23-28]。雖然5~15 a生林下參均達到文獻[29]要求,但不同年生林下參單體皂苷含量不同,隨參齡的增加Rg1、Rf、Rb1單體皂苷含量提高,而單體皂苷Compound K、原人參二醇含量下降,其次生代謝累計機理有待于進一步研究[30-31]。坡向不同林下參單體皂苷不同,陽坡林下參單體皂苷Rb2、Rb3含量最高,陰坡林下參單體皂苷Rh2含量最高,可能與溫度、光照、通風等環(huán)境條件有關。通過主成分分析可確定,Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh4、Rg5、原人參二醇以及總皂苷加和值等皂苷可作為林下參的特征皂苷,在評價林下參質(zhì)量時,可以此為據(jù)。不同林型、產(chǎn)地、參齡及坡向?qū)α窒聟⑷藚⒃碥諉误w種類沒有顯著影響,均含有14 種人參皂苷單體Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh4、Compound K、Rg5、Rh2及原人參二醇,可能是因為林下參中人參皂苷的種類是由林下參基因所決定的,而不受環(huán)境條件影響,有待于進一步驗證??梢?,在林下參的種植、采收、利用等環(huán)節(jié)中應綜合考慮林型、產(chǎn)地、參齡及坡向的選擇。