張志軍，黃克興，岳 杰，劉明麗，祁明霞，董建軍*

（啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島啤酒股份有限公司，山東 青島 266100）

啤酒是以麥芽、酒花、水為主要原料，經(jīng)酵母發(fā)酵作用釀制而成的飽含二氧化碳且乙醇體積分?jǐn)?shù)較低的酒。麥芽作為啤酒的主要原料，是大麥經(jīng)浸麥、發(fā)芽、干燥和焙焦等工藝制得的，不同品種麥芽的釀造特性和啤酒風(fēng)味存在一定差異，釀造工藝需要根據(jù)麥芽品種的特點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整?，F(xiàn)有的麥芽質(zhì)量參數(shù)如浸出率、糖化力、庫爾巴哈值等均是反映麥芽混合狀態(tài)下的平均值，非單粒麥芽質(zhì)量參數(shù)，通過常規(guī)質(zhì)量指標(biāo)無法對(duì)現(xiàn)有麥芽品種進(jìn)行區(qū)分。因此麥芽品種鑒定是評(píng)價(jià)麥芽質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是多年來啤酒企業(yè)一直迫切希望解決的難題。

目前，大麥品種鑒定技術(shù)包括形態(tài)鑒別法、蛋白質(zhì)電泳鑒別法和DNA分子標(biāo)記法等。Draper[1]利用醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行大麥品種真實(shí)性和品種純度的鑒定。林艷等[2]利用Gel-Pro軟件對(duì)大麥蛋白電泳圖譜進(jìn)行條帶分析和比較，建立了每個(gè)品種的蛋白質(zhì)“指紋”，組成加拿大啤酒大麥品種標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫，但該法存在分辨率低、鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確的問題[3]。游麗華等[4]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立澳大利亞啤酒大麥醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜。Scobie等[5]利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析西澳種植大麥蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行品種的快速鑒定。然而大麥經(jīng)發(fā)芽、干燥等制麥工藝后外觀特征已發(fā)生變化，且醇溶蛋白在蛋白酶的作用下分解，因此大麥蛋白電泳法已不適用于麥芽品種的鑒定。與從大麥葉片中提取DNA相比，麥芽中富含多糖、多酚、氨基酸等物質(zhì)，DNA分離純化難度更大。更為關(guān)鍵的是麥芽經(jīng)84～86 ℃高溫焙焦2～3 h后DNA鏈容易斷裂和降解[6]，影響聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的擴(kuò)增效果。

隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的開發(fā)和利用，DNA指紋圖譜逐漸成為鑒定種子真實(shí)性的重要方法。簡單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR），又稱微衛(wèi)星，是一類由1～5 個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列[7]。作為第2代分子標(biāo)記技術(shù)，SSR標(biāo)記具有高多態(tài)性、重復(fù)性、穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定及親緣關(guān)系等方面的研究，包括大麥[8-13]、小麥[14-17]等。谷方紅等[6]從46 對(duì)SSR引物中篩選到5 個(gè)多態(tài)性較豐富的引物，可區(qū)分實(shí)驗(yàn)的8 個(gè)大麥及麥芽品種。Lin Yan等[18]利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行大麥品種鑒定，基于4 對(duì)SSR引物建立17 種大麥品種的等位基因檢索系統(tǒng)。Amani等[19]利用11 個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)31 個(gè)北非六棱大麥品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析。常規(guī)的SSR操作是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳配合硝酸銀染色進(jìn)行基因多態(tài)性分析，該技術(shù)存在難以準(zhǔn)確讀取擴(kuò)增片段大小、分辨率低等缺點(diǎn)[20]。與常規(guī)的凝膠電泳檢測法相比，基于DNA測序儀的SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳可以得到目標(biāo)DNA片段的準(zhǔn)確大小，檢測結(jié)果更為精確，適用于大批量樣品的檢測分析，具有高靈敏度、高分辨率、快速、自動(dòng)化、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。毛細(xì)管電泳是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間的淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。毛細(xì)管電泳在檢測時(shí)要求引物必須攜帶熒光檢測器能識(shí)別的熒光染料，熒光檢測器對(duì)標(biāo)記有熒光染料的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行信號(hào)采集，通過與各泳道的分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)進(jìn)行比對(duì)，可自動(dòng)讀取產(chǎn)物片段大小。在進(jìn)行SSR引物初篩時(shí)需要檢測的引物數(shù)量較多，由于每對(duì)引物都需要進(jìn)行熒光標(biāo)記，因此這種方法的引物合成成本較高。

TP-M13-SSR（simple sequence repeat with tailed primer M13）是基于熒光測序技術(shù)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測體系，該法將M13序列作為通用接頭引入SSR熒光測序鑒定中，在不同SSR標(biāo)記進(jìn)行檢測時(shí)均可使用，熒光引物成本大幅降低，因此是一種高通量低成本的分析技術(shù)。實(shí)驗(yàn)中需要增加新的引物進(jìn)行分析時(shí)，合成常規(guī)引物即可，不用再合成熒光引物，因此實(shí)驗(yàn)成本大幅降低。此技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定及親緣關(guān)系等方面的研究，已在高粱、玉米、蘋果等植物的品種鑒定上得到應(yīng)用[21-25]。

本研究采用TP-M13-SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)國內(nèi)主要使用麥芽品種的等位基因差異性進(jìn)行研究，篩選多態(tài)性引物，構(gòu)建23 種麥芽品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫，為啤酒企業(yè)采購商業(yè)麥芽提供可靠的品種鑒定手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇23 個(gè)國內(nèi)常用的啤酒大麥品種進(jìn)行研究，包括5 個(gè)加拿大大麥、11 個(gè)澳大利亞大麥、3 個(gè)法國大麥和4 個(gè)國產(chǎn)大麥，品種名稱及來源見表1，其中加麥Copeland和Metcalfe，澳麥Scope、Bass和Commander，法麥Sebastian是國內(nèi)最常用的進(jìn)口大麥品種。對(duì)上述大麥品種進(jìn)行微型制麥，得到相應(yīng)的麥芽樣品。制麥條件參考青島啤酒微麥工藝，14 ℃浸麥44 h，15 ℃發(fā)芽4 d，45～70 ℃干燥5 h，84 ℃焙焦3 h，冷卻后去根處理，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

植物DNA試劑盒（DNeasy plant mini kit 69104） 德國Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs 美國Thermo Fisher公司；GeXP試劑 美國Beckman Coulter公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 大麥品種及產(chǎn)地Table 1 List of barley cultivars used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

C1000 Touch? PCR儀、PAC3000型電泳儀 美國Bio-Rad公司；1-15離心機(jī) 德國Sigma公司；CK1000D高通量組織研磨儀 北京托摩根公司；GenomeLab?GeXP遺傳分析系統(tǒng) 美國Beckman Coulter公司；Ultrospec2100紫外分光光度計(jì) 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA的提取

取單粒麥芽樣品于2.0 mL離心管中，加入8 mm鋼珠一顆，高通量組織研磨儀1200 r/min粉碎1 min，利用Qiagen植物DNA試劑盒進(jìn)行提取。提取的DNA用100 μL超純水或TE溶解，并用2%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)測定所提DNA的純度與質(zhì)量濃度。將所提DNA質(zhì)量濃度稀釋到20 ng/μL，置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SSR引物合成

第1條引物是SSR正向引物的5’端和M13引物相連合成帶有M13尾巴的引物，即TP-M13引物；第2條引物為正常的SSR反向引物；第3條引物是5’端標(biāo)記有Alexa Fluor 750熒光的M13通用引物。所述M13通用引物的引物序列為TGTAAAACGACGGCCAGT。

1.3.3 反應(yīng)條件

PCR體系反應(yīng)體積為20 μL，含MgCl22.5 mmol/L，dNTP 0.20 mmol/L，帶有M13尾巴序列的特異正向引物0.04 μmol/L、反向引物0.16 μmol/L，M13熒光引物0.12 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，2×PCR緩沖液（不含Mg2+），樣品DNA 10～50 ng。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.4 產(chǎn)物分離

制備甲酰胺上樣緩沖液（sample loading solution，SLS）-DNA分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)（DNA size standard kit，DSS）混合液：取0.5 μL的DSS-400，加入39.5 μL的SLS，渦旋振蕩器上混合均勻，加入樣品板中。PCR產(chǎn)物稀釋處理，樣品孔中加入稀釋后的PCR產(chǎn)物1 μL，加1 滴石蠟油覆蓋樣品；在緩沖液板內(nèi)加入3/4體積的分離緩沖液。將上樣板和緩沖板放入GenomeLab? GeXP遺傳分析系統(tǒng)儀中，進(jìn)樣電壓2.0 kV，時(shí)間30 s；90 ℃變性120 s；分離電壓6.0 kV，時(shí)間35 min。在毛細(xì)管凝膠電泳過程中，PCR產(chǎn)物與DSS-400分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)的熒光信號(hào)均由基因分析儀自動(dòng)保存。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析和指紋圖譜構(gòu)建

用GeneMapper-V3.0軟件對(duì)GeXP遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過人工分析與軟件統(tǒng)計(jì)得出不同麥芽的SSR標(biāo)記片段。利用軟件將SSR標(biāo)記片段與DSS-400分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)比較，得到SSR標(biāo)記片段長度大小。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)麥芽樣品擴(kuò)增片段的毛細(xì)管電泳圖譜，將檢測峰判讀為對(duì)應(yīng)的等位基因，純合位點(diǎn)的等位基因記錄為X，雜合位點(diǎn)的等位基因記錄為X/Y，其中X、Y為該位點(diǎn)上2 個(gè)不同的等位基因片段大小，小片段在前，大片段在后。采用1～9的個(gè)位數(shù)字和26 個(gè)英文字母的組合對(duì)檢測峰進(jìn)行編碼，數(shù)字代表引物順序，字母代表等位基因編碼，每對(duì)引物都有對(duì)應(yīng)的數(shù)字和字母組合便于快速識(shí)別。對(duì)一個(gè)給定的SSR引物，不同的品種會(huì)同時(shí)存在幾個(gè)等位基因，根據(jù)等位基因的大小進(jìn)行排序，最小的定為a，然后根據(jù)分子質(zhì)量的大小依次定位為b、c、d等[26]，從而構(gòu)建麥芽品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物篩選

根據(jù)相關(guān)報(bào)道[27-29]，從大麥7 條染色體中選擇163 對(duì)SSR引物，以8 個(gè)麥芽品種的DNA為模板，每對(duì)引物至少重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，選擇多態(tài)性好的引物作為初篩引物。利用23 個(gè)麥芽品種對(duì)初篩引物進(jìn)行二次篩選，最終得到4 對(duì)穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、PCR穩(wěn)定的SSR引物，見表2。

表2 引物序列信息及染色體位置Table 2 Primer sequences and their chromosome locations

2.2 SSR引物多態(tài)性分析

利用篩選出的4 對(duì)SSR引物對(duì)23 個(gè)麥芽品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得不同品種在各等位基因上的片段，從毛細(xì)管凝膠電泳圖譜中選擇擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、重復(fù)性好的檢測峰作為等位基因位點(diǎn)用于品種多樣性分析。結(jié)果表明，4 對(duì)引物共檢測出27 個(gè)等位基因，每對(duì)引物的等位基因?yàn)?～10 個(gè)不等，平均每個(gè)引物產(chǎn)生6.75 個(gè)等位基因，多態(tài)性良好。其中位點(diǎn)HVM68多態(tài)性最豐富，在183～313 bp之間包括10 個(gè)等位基因；位點(diǎn)HVWAXYG多態(tài)性其次，在185～222 bp之間含有9 個(gè)等位基因；位點(diǎn)EBmac755在144～159 bp之間含有5 個(gè)等位基因；位點(diǎn)Scssr10148多態(tài)性最低，在199～241 bp僅含有3 個(gè)等位基因。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小的差異可以用于麥芽品種的區(qū)分，引物擴(kuò)增片段的等位基因數(shù)越多，越能反映不同品種的差異。

2.3 麥芽品種SSR指紋圖譜的建立

圖1 Copeland（A）和Baudin（B）在4 個(gè)SSR位點(diǎn)的TP-M13-SSR指紋圖譜Fig. 1 TP-M13-SSR fingerprinting of Copeland (A) and Baudin (B) at 4 SSR loci

利用4 對(duì)引物的組合構(gòu)建全部23 個(gè)麥芽品種的TPM13-SSR指紋圖譜。每個(gè)品種在不同引物下的擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳上進(jìn)行分離后，根據(jù)電泳圖譜上的峰值變化將主要檢測峰判讀為對(duì)應(yīng)的等位基因，綜合擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜和等位基因大小，就構(gòu)成了每個(gè)麥芽品種的SSR指紋圖譜，作為麥芽品種間區(qū)分的判定依據(jù)。如圖1所示，對(duì)全部麥芽品種的電泳圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)每一個(gè)麥芽品種在4 對(duì)引物下都有自己獨(dú)特的指紋圖譜組合，因此通過指紋圖譜可實(shí)現(xiàn)不同麥芽品種的有效區(qū)分。

表3 23 種麥芽在4 個(gè)SSR位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)Table 3 Standard fingerprint data of 23 varieties of malt at 4 SSR loci

根據(jù)每個(gè)麥芽品種在4 個(gè)位點(diǎn)上等位基因差異的變化，按照引物順序建立23 個(gè)麥芽品種的指紋數(shù)據(jù)，如表3所示。不同麥芽品種間等位基因之間差異大小不等，加麥Copeland和澳麥Baudin在4 對(duì)引物中等位基因大小均不相同，二者差異明顯，易于區(qū)分；而同為加麥的Copeland和Metcalfe二者在引物Scssr10148、HVWAXYG和EBmac755上等位基因大小完全一致，只在引物HVM68才有差異，說明2 個(gè)品種比較接近區(qū)分難度較大。

2.4 麥芽品種的區(qū)分

表4 23 種麥芽在4 個(gè)SSR位點(diǎn)的的SSR標(biāo)準(zhǔn)指紋編碼Table 4 SSR standard fingerprint coding of 23 varieties of malt at 4 SSR loci

根據(jù)SSR指紋圖譜，將每對(duì)引物擴(kuò)增的條帶按照從小到大的順序排列，依次編碼[30]。本研究利用4 對(duì)多態(tài)性豐富的SSR引物可準(zhǔn)確鑒別的23 個(gè)麥芽品種，各麥芽品種的特征指紋代碼見表4。按照固定引物順序?qū)⒚總€(gè)品種指紋圖譜所對(duì)應(yīng)的編碼按特定的引物順序排列起來，就構(gòu)成了代表各品種身份的特征指紋代碼，4 對(duì)引物下加麥Copeland指紋代碼為1h2g3d4c，澳麥Gairdner的指紋代碼為1a2e3e4c。如檢測某未知麥芽樣品，可先用4 對(duì)特定引物對(duì)待測麥芽樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測，將等位基因型所對(duì)應(yīng)的代碼按引物順序排列起來，與標(biāo)準(zhǔn)麥芽的指紋代碼進(jìn)行比對(duì)，即可直觀地判定出待測樣品是否是目標(biāo)品種，從而實(shí)現(xiàn)麥芽品種真實(shí)性的判斷。采用1～9的個(gè)位數(shù)字和26 個(gè)英文字母的組合對(duì)檢測峰進(jìn)行編碼，每對(duì)引物都有對(duì)應(yīng)的數(shù)字和字母組合便于快速識(shí)別，避免了僅使用數(shù)字編碼時(shí)因等位基因過多需要兩位數(shù)字進(jìn)行編碼的情況。

表5 23 種麥芽品種區(qū)分的等位基因組合Table 5 Allele combinations for identification of 23 malt varieties

如表5所示，23 個(gè)麥芽品種中4 對(duì)引物可單獨(dú)區(qū)分的品種為0～5 個(gè)不等，HVM68可直接區(qū)分5 個(gè)品種，HVWAXYG可區(qū)分3 個(gè)品種，Scssr10148和EBmac755可區(qū)分0 個(gè)品種。引物間相互組合提高可區(qū)分品種數(shù)量，進(jìn)而確定引物的最佳組合。兩引物組合中HVM68和HVWAXYG組合可實(shí)現(xiàn)17 個(gè)品種的區(qū)分，區(qū)分率最高，為73.9%；引物Scssr10148和EBmac755組合可實(shí)現(xiàn)6 個(gè)品種的區(qū)分，區(qū)分率最低，為26.1%?？筛鶕?jù)兩引物組合的結(jié)果繼續(xù)增加引物數(shù)量，提高品種的區(qū)分能力。在HVM68和HVWAXYG組合基礎(chǔ)上，增加EBmac755可實(shí)現(xiàn)23 個(gè)麥芽品種的全部區(qū)分，區(qū)分率為100%，該組合為最佳引物組合。因此僅需要3 對(duì)核心引物（HVM68、HVWAXYG和EBmac755）的組合即可實(shí)現(xiàn)全部23 個(gè)麥芽品種的區(qū)分。未來隨著麥芽品種數(shù)量的增加，某些品種間的指紋圖譜可能完全相同，4 對(duì)引物組合的鑒定能力可能會(huì)逐漸降低，可通過增加新的多態(tài)性引物提高引物組合的區(qū)分能力。

3 結(jié) 論

常用的SSR分析是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染進(jìn)行片段多態(tài)性分析，該法靈敏度和分辨率較低，不能準(zhǔn)確量化擴(kuò)增片段的大小，無法在不同凝膠圖譜之間進(jìn)行橫向比較。基于DNA測序儀的SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳可以得到目標(biāo)DNA片段的準(zhǔn)確大小，具有高靈敏度、高分辨率、快速、自動(dòng)化、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。TPM13-SSR技術(shù)是SSR技術(shù)與熒光自動(dòng)測序技術(shù)的完美整合，在大批量引物篩選的情況下，M13通用引物可大大降低SSR引物熒光標(biāo)記的成本，方法簡便可靠，適用于麥芽品種指紋圖譜的構(gòu)建。本研究從163 對(duì)SSR引物中篩選到4 對(duì)多態(tài)性豐富的SSR引物，每對(duì)引物的等位基因?yàn)?～10 個(gè)不等，平均每個(gè)引物產(chǎn)生6.75 個(gè)等位基因。利用4 對(duì)SSR引物構(gòu)建23 個(gè)麥芽品種的指紋圖譜及對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，僅需3 對(duì)核心引物即可實(shí)現(xiàn)全部麥芽品種的區(qū)分，該法檢測成本低，方法準(zhǔn)確可靠，可實(shí)現(xiàn)國內(nèi)啤酒行業(yè)常用麥芽品種的真實(shí)性鑒定，從源頭上保障啤酒原料的品質(zhì)，為啤酒企業(yè)在麥芽采購環(huán)節(jié)提供技術(shù)支持。