文淑婷，李 艷,2,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

老白干香型是我國(guó)白酒第11類香型，代表酒為衡水老白干酒，該酒自然協(xié)調(diào)、清雅獨(dú)特的香氣與其所用的酒曲密不可分。在白酒生產(chǎn)過程中，一直有“曲為酒骨”的說法，酒曲對(duì)于白酒的生產(chǎn)至關(guān)重要。酒曲中微生物組成復(fù)雜，其中酵母菌、細(xì)菌和霉菌這3 類微生物占據(jù)很大的比重。傳統(tǒng)的酵母菌分離是通過將酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)，WL培養(yǎng)基鑒別，結(jié)合菌落和顯微形態(tài)特征可將其進(jìn)行初步形態(tài)聚類[1-6]，再利用限制性片段多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析進(jìn)行分子水平的分類。26S rDNA D1/D2序列分析和5.8S-ITS RFLP[7]是廣泛應(yīng)用的兩種分析鑒定技術(shù)。Esteve-Zarzoso等[8]將5.8S-ITS RFLP指紋技術(shù)應(yīng)用于食品和發(fā)酵飲料中酵母菌的分類和鑒定；馬凱等[9]則以26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析法對(duì)15 株菌進(jìn)行相關(guān)的分類研究；文獻(xiàn)[1,10-14]均用到此法對(duì)菌種進(jìn)行分析鑒定。

如今，變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）因具有快速、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于目標(biāo)樣品中微生物的多樣性分析[15-19]，Durand[20]和Sha[21]等分別將DGGE技術(shù)應(yīng)用于赭曲霉毒素A產(chǎn)生相關(guān)的真菌群體和發(fā)酵劑中酵母菌群多樣性的研究。該技術(shù)的工作原理是使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)DNA進(jìn)行電泳，長(zhǎng)度相同而在堿基序列上存在差異的DNA雙鏈的解鏈需要不同的變性劑濃度，不同的酵母菌被分開，實(shí)現(xiàn)了基因組水平的分離、純化。該技術(shù)如今已經(jīng)普遍應(yīng)用于酒曲中微生物的群落結(jié)構(gòu)研究。程才瓔[22]和譚映月[23]等在對(duì)醬香型白酒酒曲中的微生物多樣性研究中采用的技術(shù)為DGGE；姚淑敏等[24]提取6 種甜酒酒曲的總DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）聯(lián)合技術(shù)共鑒定得到3 種真菌和不可培養(yǎng)真菌；閆華文[25]利用DGGE針對(duì)不同地區(qū)的6 種甜酒曲進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其主要真菌為釀酒酵母、扣囊復(fù)膜酵母、米根霉以及不可培養(yǎng)真菌；李艷等[2]利用PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)到羊羔美酒大曲中6 種細(xì)菌和4 種不可培養(yǎng)的細(xì)菌種類；趙東[26]在對(duì)西藏青稞酒酒曲的研究中曾論述道：PCR-DGGE彌補(bǔ)了以往微生物培養(yǎng)分離時(shí)間長(zhǎng)、效率低下的缺陷，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微生物較全面的分離鑒定。培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)方法能夠很好地結(jié)合，非培養(yǎng)方法為培養(yǎng)方法提供基礎(chǔ)的菌群關(guān)系、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件信息，而培養(yǎng)方法可以補(bǔ)充非培養(yǎng)方法沒有發(fā)現(xiàn)的菌群，得到菌株加以馴化和利用，兩種方法相互補(bǔ)充。目前鮮見老白干酒曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究，本研究采用培養(yǎng)和非培養(yǎng)兩種方法對(duì)老白干酒曲中的酵母菌進(jìn)行分離鑒定，確定其屬、種。采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)老白干酒曲中酵母菌的多樣性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究老白干酒曲的發(fā)酵能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

老白干香型酒曲 衡水老白干酒業(yè)股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L；WL培養(yǎng)基[2-6]：胰蛋白胨5 g/L，酵母浸粉4 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，氯化鉀0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，氯化鐵0.002 5 g/L，硫酸錳0.002 5 g/L，氯化鈣0.125 g/L，溴甲酚綠0.022 g/L，瓊脂20 g/L，pH 5.5±0.2。

1.1.3 分子試劑

PCR引物：上游引物NL1（5’-GCATATC AATAAGCGGAGGAAAAG-3’），下游NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）；DGGE專用引物：上游引物GC-NL1（5’-CGCCCGCCG CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCATATCA ATAAGCGGAGGAAAAG-3’），下游引物 LS2（5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’）；Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶HinfI、HhalI和HaeIII均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（以下簡(jiǎn)稱上海生工公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

DP-200低溫培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；ZQTY-70振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；AR1140分析天平美國(guó)Ohaus公司；ZQTY-70 PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像分析儀、DGGE儀 美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-8C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京市六一儀器廠；SW-CJ-1BU潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；XS-212-202雙目顯微鏡（配有單反相機(jī)D5100） 尼康映像儀器銷售有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌形態(tài)學(xué)鑒定

1.3.1.1 酒曲樣品預(yù)處理

將塊狀酒曲研磨成粉，過40 目篩。準(zhǔn)確稱取1 g酒曲粉，倒入盛有9 mL無菌水的錐形瓶中，至搖床160 r/min振蕩培養(yǎng)0.5 h得到菌液。將菌液于10 mL無菌稀釋管中進(jìn)行梯度稀釋，取0.2 mL 10－2、10－3、10－4等合適稀釋度的菌液分別均勻涂布于YEPD培養(yǎng)基平板上，28 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.1.2 酵母菌的分離

培養(yǎng)12 h后，每2 h觀察一次，挑取疑似酵母菌的菌落，劃線接種在新的YEPD培養(yǎng)基上[27]，同時(shí)作好實(shí)驗(yàn)觀察記錄。

1.3.1.3 酵母菌的純化

將篩選得到的酵母菌在YEPD培養(yǎng)基上重復(fù)純化2～3 次，直到菌落為單菌株形成的菌落，再將其保藏。

1.3.1.4 酵母菌的形態(tài)聚類

將純化菌劃線接種于WL培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察菌落特征[2-6]。并進(jìn)行顯微形態(tài)觀察，記錄菌落的大小和形狀，對(duì)菌株進(jìn)行顯微形態(tài)聚類。

1.3.2 26S rDNA D1/D2序列分析法鑒定酵母菌

1.3.2.1 DNA的提取

每種形態(tài)隨機(jī)選取1株保藏的酵母菌，反復(fù)活化培養(yǎng)2～3 次，28 ℃培養(yǎng)48 h，得到酵母菌單菌落。采用熱裂解法[1]提取酵母菌DNA：吸取30 μL 0.25%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液放在離心管中，挑取大小合適的單菌落于管中混勻，振蕩30～40 s，90℃水浴鍋中水浴4 min，冰浴5min，13 000 r/min離心3.5 min，吸取上清液于0.2 mL的離心管中。－20 ℃保藏備用。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增為50 μL體系：上、下游引物各1 μL，Buffer（10×）5 μL，dNTP 1 μL，Taq酶0.5 μL，雙蒸水40.5 μL，DNA 1 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸80 s，循環(huán)36 次；再72 ℃延伸8 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.2.3 26S rDNA D1/D2的RFLP分析

利用限制性內(nèi)切酶HhalI、HinfI和HaeIII進(jìn)行酶切分析，根據(jù)酶切結(jié)果對(duì)酵母均進(jìn)行分子聚類[2,4-5]。20μL酶切體系：無菌雙蒸水9 μL，buffer 2 μL，酶1 μL，PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL。酶切條件：37℃水浴2.5h。用2%的瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)酶切的結(jié)果80～90 V電泳50～60min，在凝膠成像儀下拍照。

1.3.2.4 測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。登錄NCBI上的BLAST將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性分析[4]，同時(shí)向NCBI提交序列獲得GenBank登錄號(hào)。

1.3.3 PCR-DGGE法鑒定酒曲中的酵母菌

1.3.3.1 原料的預(yù)處理

酒曲樣品經(jīng)粉碎成粒狀并過濾，稱取4 g酒曲，加入36 mL磷酸鹽緩沖溶液（可以用去離子水代替）200 r/min搖床振蕩30 min，旋渦振蕩5 min之后用4 層紗布過濾，濾液200 r/min離心5 min，取上清液8 000 r/min離心3 min之后得到的沉淀加入5 mL磷酸鹽緩沖溶液，旋渦振蕩5 min，離心沉淀，重復(fù)2 次。最終將所得沉淀溶解于1 200 μL無菌水中，將樣品置于－20 ℃貯藏備用。

1.3.3.2 DNA提取

預(yù)先稱取玻璃珠0.3～0.5 g于1.5 mL的離心管中，依次加入處理的樣品250 μL，再加入250 μL TE緩沖液，最終在旋渦振蕩儀振蕩3～5 min。再加10% SDS 50 μL、氯化芐150 μL、蛋白酶K 10 μL在旋渦振蕩儀振蕩3～5 min。直至混合物呈現(xiàn)乳濁的狀態(tài)，于50 ℃水浴10 min，混勻一次。重復(fù)上述操作5次。水浴結(jié)束之后加入3 mol/L NaAc溶液（pH 5.2）150 μL再混勻，－20 ℃放置持續(xù)15 min，12 000 r/min離心10 min之后得到上清液。小心取上清液放置于新1.5 mL已滅菌的離心管中，使用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）抽提2 次，最終用氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）的溶液抽提1次。小心吸出上層液體于一新1.5 mL已滅菌的離心管中，拿出已經(jīng)預(yù)冷好的異丙醇，加入上清液2 倍體積的異丙醇和1/10體積的3 mol/L NaAc溶液（pH 5.2）慢慢混勻，之后置于－20 ℃放置沉降2 h。2 h之后取出樣品12 000 r/min離心10 min，再用70%的乙醇溶液洗滌2 次，自然晾干，加入30 μL TE緩沖液，－20 ℃貯藏備用。

1.3.3.3 PCR儀擴(kuò)增片段

在超凈臺(tái)中配制好PCR體系之后用PCR擴(kuò)增儀按照

1.3.2.2 節(jié)中PCR擴(kuò)增的程序進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3.3.4 變性膠溶液配制

按表1配比配制變性膠溶液，4 ℃保存待用。

表1 不同變性劑濃度膠溶液的配制Table 1 Preparation of gels with different denaturant concentrations

1.3.3.5 灌膠

先用滅菌水將玻璃板清洗干凈、晾干，再組裝玻璃板。分別向高、低濃度凝膠溶液中加入四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethane-1,2-diamine，TEMED）和10%過硫酸銨溶液上下劇烈混勻（每16 mL的膠溶液加入TEMED 18 μL，10%過硫酸銨80 μL）。將高、低濃度膠溶液分別吸入標(biāo)有高濃度注射器（HI注射器）和低濃度注射器（LO注射器），之后穩(wěn)定固定在梯度灌膠器上。三通接頭的兩端連接HI注射器和LO注射器的灌膠管，另外一頭連接著通向膠板的軟管。手動(dòng)緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)齒輪開始灌膠，盡可能保持勻速。灌膠結(jié)束，插入尺梳，等待下層膠凝固，約需1～2 h（時(shí)間隨室溫而變）。灌入不含變性劑的上層膠，凝固時(shí)間約20～30 min。待上層膠溶液凝聚完成后，稍稍拔去梳齒檢驗(yàn)?zāi)z是否擰好。

1.3.3.6 電泳

將制好的膠從制膠板上取下，將電泳液倒入電泳槽中并將玻璃板及夾具安裝好，放入電泳槽內(nèi)。 依次打開電泳儀的電源、回流泵及控溫裝置，設(shè)置需要的溫度（60 ℃），等待電泳緩沖液加熱至設(shè)置溫度，上、下層緩沖液形成電流通路進(jìn)行預(yù)電泳。200 V預(yù)電泳20 min。預(yù)電泳結(jié)束后開始點(diǎn)樣，樣品為PCR產(chǎn)物，與對(duì)應(yīng)量的loading buffer混合均勻，用移液針點(diǎn)入加樣孔中。重新打開各個(gè)開關(guān)，設(shè)置電泳所需的電壓與時(shí)間，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠玻璃板，溴化乙錠染色電泳膠，時(shí)間為20～30 min。利用凝膠成像儀觀察DGGE凝膠的情況。

1.3.3.7 切膠與回收

準(zhǔn)備鋒利刀片，在凝膠儀的紫外燈照射下，切下目標(biāo)的條帶，置于1.5 mL離心管中。用適量滅菌雙蒸水清洗條帶，重新加入30 μL滅菌雙蒸水，同時(shí)搗碎凝膠使DNA盡量溶出。取適量的浸泡溶液作為下一步PCR擴(kuò)增模板，測(cè)序與數(shù)據(jù)分析同1.3.2.4節(jié)方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌形態(tài)學(xué)鑒定

從老白干酒曲中分離到57 株酵母菌。利用WL培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)對(duì)酵母菌的形態(tài)聚類，再在顯微鏡下觀察、記錄各個(gè)形態(tài)類型酵母菌的形態(tài)、大小，初步區(qū)分到6 種形態(tài)，其中各個(gè)形態(tài)的菌落形態(tài)描述、所占比例、酵母菌個(gè)體大小等如表2所示。6 種酵母的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)見圖1。

表2 WL培養(yǎng)基上酵母菌的形態(tài)特征及數(shù)量Table 2 Morphological characteristics and size of yeast strains cultured on WL medium

圖1 各菌株菌落形態(tài)和顯微形態(tài)Fig. 1 Colony morphology and micromorphology of various strains

根據(jù)表2和圖1可以看出，形態(tài)3和形態(tài)6分別占總酵母菌株數(shù)量的35.1%和24.6%，兩者共占總酵母菌種的59.7%，這兩種酵母為老白干酒曲中的優(yōu)勢(shì)酵母，形態(tài)2和形態(tài)4的比例分別為21.0%、15.8%。比例最少的形態(tài)種類為形態(tài)1和形態(tài)5，均為1.75%。其中形態(tài)5的顏色呈現(xiàn)紅色，張紅霞[28]曾經(jīng)對(duì)清香大曲中的微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，通過培養(yǎng)分類的手段得到一種正面呈現(xiàn)紅色，形態(tài)呈現(xiàn)球狀凸起，表面光滑的酵母菌，經(jīng)分子鑒定為膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa），該酵母與本研究中得到的形態(tài)5極度相似。

2.2 26S rDNA D1/D2 序列分析

2.2.1 酵母菌形態(tài)的酶切分析

本研究隨機(jī)選取各個(gè)形態(tài)的酵母菌各1株。用SDS熱裂解法提取其DNA，以酵母菌DNA為模板進(jìn)行PCR程序，結(jié)果見圖2A。由圖2A可知，擴(kuò)增出的形態(tài)1～6酵母菌的26S rDNA片段均在600 bp左右且條帶明亮清楚，其中比較明顯的是形態(tài)3擴(kuò)增產(chǎn)物在540 bp左右，形態(tài)1擴(kuò)增產(chǎn)物在640 bp左右，其他4 種形態(tài)基本都在610 bp左右，6 種形態(tài)的酵母菌擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度相當(dāng)，但是其序列不同。進(jìn)行限制性內(nèi)切酶RFLP分析可以將酵母菌進(jìn)行進(jìn)一步聚類分析，不同的酵母菌序列經(jīng)過3 種酶的作用，其產(chǎn)物有所差異，實(shí)驗(yàn)用到的限制性內(nèi)切酶有HhalI、HinfI和HaeIII，3 種酶的酶切圖譜分別見圖2B、C、D。

圖2 PCR產(chǎn)物及3 種內(nèi)切酶酶切分析圖譜Fig. 2 PCR electrophoretogram and restriction analysis patterns of PCR-amplified 26S rDNA D1/D2 region

由圖2B、C、D中可以分析得到共5 個(gè)分子類型。形態(tài)2和形態(tài)6在3 種酶的酶切作用下得到的片段均相同，經(jīng)過HaeIII酶酶切為220 bp和240 bp 2 個(gè)片段，經(jīng)HhalI酶酶切為180 bp和230 bp 2個(gè)片段，經(jīng)過HinfI酶酶切后分為120 bp和400 bp 2 個(gè)片段，所以形態(tài)2和形態(tài)6為一種分子類型。其他的4 種形態(tài)分別被酶切成互不相同的片段，所以可以把6個(gè)形態(tài)類型歸為5 種分子類型，結(jié)果見表3。

表3 6 種不同形態(tài)的26S rDNA PCR-RFLP結(jié)果Table 3 26S rDNA PCR-RFLP analysis of six kinds of yeast

2.2.2 測(cè)序結(jié)果及同源性分析

將擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至上海生工公司測(cè)序獲得序列結(jié)果，登錄NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，并向NCBI提交序列，獲得GenBank的登錄號(hào)，見表4。菌株序列的相似度比對(duì)結(jié)果均在98%～100%，在GenBank中下載與相應(yīng)物種分子類型相似度高的菌株序列，再利用MEGA4和鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

表4 5種分子類型的26S rDNA D1/D2序列測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination of 26S rDNA D1/D2 sequence of five molecular types

圖3 基于26S rDNA D1/D2序列利用MEGA4和鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 sequence using MEGA4 and neighbor-joining methods

由圖3可清楚判斷出酵母菌的同源關(guān)系遠(yuǎn)近，各個(gè)菌株分支獨(dú)立分別屬于不同的種屬。P. kudriavzevii和C. lusitaniae分別占總酵母數(shù)的45.6%和35.1%，為主勢(shì)菌；W. anomalus僅占15.8%；T. asahii和R. mucilaginosa均為1 株，所占比例為1.75%，為數(shù)量較少的酵母菌。Jeyaram等[29]對(duì)印度一種傳統(tǒng)的發(fā)酵劑（類似酒曲）中的酵母菌進(jìn)行研究，分離到的酵母菌有Saccharomyces cerevisiae、P. kudriavzevii、Hansenula anomala、T. asahii、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）等，P. kudriavzevii為其中主勢(shì)菌之一，這一點(diǎn)與本研究結(jié)果一致。P. kudriavzevii能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖和木糖兩種糖，能最大限度實(shí)現(xiàn)乙醇的轉(zhuǎn)化。惠豐立等[30]從河南臥龍酒廠提供的中溫大曲中共分離得到92 株酵母菌，通過5.8S-ITS RFLP 指紋圖譜分析后，得到12 個(gè)不同的類群。從各個(gè)類群中隨機(jī)選取代表菌株進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，大曲中酵母菌主要為Saccharomyces、Pichia、Zygosaccharomyces、Candida、Rhodotorula、Issatchenkia等9 個(gè)已知酵母菌屬。本研究中也同樣鑒定得到P. kudriavzevi、R. mucilaginosa兩種酵母屬的菌株。C. lusitaniae、R. mucilaginosa和T. asahii雖然屬非釀酒酵母，但卻是產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，蔣文鴻[31]篩選了昌黎和濟(jì)源兩地產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，其中就有C. lusitaniae、R. mucilaginosa和T. asahii。發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶的出現(xiàn)可以使香氣物質(zhì)從結(jié)合態(tài)變成游離態(tài)[32]，達(dá)到增香的效果。該菌株對(duì)老白干香型白酒特異性香氣的形成具有一定的促進(jìn)作用。王玉霞[33]在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)釀酒酵母出現(xiàn)的頻率較少，只在發(fā)酵后期出現(xiàn)，發(fā)酵前期出現(xiàn)的大部分是非釀酒酵母。這一點(diǎn)可以為本研究未分離到釀酒酵母作出解釋，釀酒酵母的出現(xiàn)大多是在發(fā)酵后期。W. anomalus具有產(chǎn)苯乙醇能力[34]，為白酒產(chǎn)香發(fā)揮正向作用，增添風(fēng)味屬于酒曲中不可缺少的一類酵母。非釀酒酵母的存在為老白干香型的白酒增添風(fēng)味，是酒曲中不可或缺的酵母菌。

2.3 PCR-DGGE法鑒定酒曲中酵母菌

圖4 酒曲中DGGE優(yōu)勢(shì)條帶Fig. 4 Dominant DGGE bands in Laobaigan liquor Daqu

利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)酵母菌進(jìn)行鑒定得到DGGE圖譜條帶見圖4。通過對(duì)回收的條帶進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增，再委托上海生工公司測(cè)序，獲得了片段序列和NCBI上的BLAST結(jié)果。

表5 PCR-DGGE圖譜條帶的測(cè)序結(jié)果Table 5 Sequencing of PCR-DGGE bands

PCR-DGGE非培養(yǎng)方式分離得到10 株條帶比較亮的優(yōu)勢(shì)菌見表5，其中H. burtonii 2 株，W. anomalus、Wickerhamomyces sp.、T. asahii、C. tropicalis和Candida sp.各1 株，還有3 株為未知的不可培養(yǎng)酵母uncultured Saccharomycopsis。根據(jù)DGGE圖，其他條帶較淺，不滿足切膠條件，通過PCR-DGGE方式從遺傳基因上證明了酒曲中酵母菌的多樣性。W. anomalus和T. asahii是兩類產(chǎn)生香氣物質(zhì)的酵母菌。高亦豹[35]利用26S rRNA D1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，再經(jīng)過DGGE實(shí)驗(yàn)在大曲中鑒定得到T. asahii、W. anomalus、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）等13 種酵母菌，本研究中也相應(yīng)檢測(cè)到T. asahii、W. anomalus和3 株不可培養(yǎng)酵母uncultured Saccharomycopsis，其結(jié)果與本研究基本一致。在酒曲中非釀酒酵母菌一般在發(fā)酵初期參與發(fā)酵代謝，產(chǎn)生一些非常重要的二級(jí)代謝產(chǎn)物，在一定程度上能提高白酒風(fēng)味的復(fù)雜性，同時(shí)能夠分泌酶的酵母對(duì)白酒的風(fēng)味物質(zhì)形成具有一定的催化作用。姚淑敏等[24]利用PCR-DGGE對(duì)甜酒曲中的真菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)的酒曲中的真菌除了酵母屬之外，不可培養(yǎng)真菌在甜酒曲中也起到非常重要的作用，這一點(diǎn)印證了本研究的檢測(cè)結(jié)果。

2.4 培養(yǎng)和非培養(yǎng)方法鑒定結(jié)果比較

培養(yǎng)方式和非培養(yǎng)方式分別鑒定得到5、10 種分子類型，其中培養(yǎng)方式得到的酵母均能夠采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)，而非培養(yǎng)PCR-DGGE技術(shù)分離得到可培養(yǎng)酵母7 種，不可培養(yǎng)的酵母3 種。一方面，由于PCR-DGGE技術(shù)為直接提取酒曲中總DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，所以能夠?qū)魄袩o法通過培養(yǎng)手段分離得到的酵母菌進(jìn)行鑒定，本研究中鑒定得到了3 株uncultured Saccharomycopsis。彭?xiàng)畹萚36]基于PCR-DGGE技術(shù)對(duì)四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過程中真菌進(jìn)行微生物群落分析，分離鑒定到12 株真菌，其中亦有3 株不可培養(yǎng)的真菌，姚淑敏等[24]在甜酒曲中利用DGGE技術(shù)分離得到不可培養(yǎng)真菌1 株，不可培養(yǎng)的真菌在酒曲中也占有一定比重。

另一方面，兩種鑒定技術(shù)均得到W. anomalus和T. asahii，而C. lusitaniae、R. mucilaginosa、P. kudriavzevii則通過培養(yǎng)方式得到，PCR-DGGE技術(shù)并未鑒定到這3 種菌。傳統(tǒng)的菌株分離與菌株的活性以及培養(yǎng)基的適宜性密切相關(guān)，故而分離得到的酵母菌與PCR-DGGE技術(shù)鑒定結(jié)果具有差異性。在DNA抽提過程中，群落中含量很少的一些菌株，用常規(guī)的DNA提取方法可能提不到或提到微量的DNA，這會(huì)影響其PCR擴(kuò)增，從而導(dǎo)致PCRDGGE技術(shù)無法檢測(cè)到[37]。同時(shí)，針對(duì)非培養(yǎng)酵母，則只能利用PCR-DGGE技術(shù)鑒定得到。PCR-DGGE技術(shù)具有檢測(cè)限低、準(zhǔn)確、同時(shí)可檢測(cè)多個(gè)樣品的優(yōu)點(diǎn)，但是也具有一定的局限性，繁雜的DNA提取、擴(kuò)增可能會(huì)引起分析誤差。培養(yǎng)與非培養(yǎng)鑒定技術(shù)具有差異性但卻相互補(bǔ)充，將兩者結(jié)合使用則能夠更加全面和清楚地探究老白干酒曲中的酵母菌多樣性。

3 結(jié) 論

本研究通過培養(yǎng)方式分離純化到57 株酵母菌，分為6 種形態(tài)，5 種分子類型，分別為P. kudriavzevii、C. lusitaniae、W. anomalus、R. mucilaginosa、T. asahii。其中，P. kudriavzevii和C. lusitaniae分別占總菌株數(shù)的45.7%和35.1%，為優(yōu)勢(shì)菌群。PCR-DGGE法鑒定得到10 株酵母菌，分別為H. burtonii 2 株，W. anomalus、Wickerhamomyces sp.、T. asahii、C. tropicalis和Candida sp.各1 株，uncultured Saccharomycopsis 3 株，PCR-DGGE法分離純化酵母菌直接、快速，能夠更詳細(xì)準(zhǔn)確地鑒定出酒曲中的酵母菌。采用培養(yǎng)與非培養(yǎng)兩種方式探究老白干酒曲中的酵母菌，兩種方法各有特點(diǎn)且相互補(bǔ)充，共得到屬于8 個(gè)屬中的10 株酵母，包括P. kudriavzevii、C. lusitaniae、W. anomalus、R.mucilaginosa、T. asahii、H. burtonii、Wickerhamomyces sp.、 C. tropicalis、 Candida sp.、 uncultured Saccharomycopsis，為后續(xù)進(jìn)一步研究該香型白酒的風(fēng)味特征和酒曲發(fā)酵性能提供理論支持。