吳瑜凡，申進玲，崔思宇，郭 旸，吳福平，王 翔，邵景東,*

（1.張家港出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心，江蘇 張家港 215600；2.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093）

自然界中存在著大量的可移動遺傳元件，如轉座子、質(zhì)粒等，這些外源核酸片段在原核生物中的水平轉移推動了原核生物進化的多樣性，同時也促使細菌、古菌等進化出一套抵御基因水平轉移的機制[1]。規(guī)律成簇間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關蛋白（Cas蛋白等）就是在細菌和古菌中新發(fā)現(xiàn)的針對噬菌體、質(zhì)粒等外源核酸片段入侵的原核生物免疫系統(tǒng)。目前研究表明，在已測序的基因組中，大約有40%的細菌和90%的古菌基因組中至少存在1個CRISPR座位（locus）[2]。完整的CRISPR-cas系統(tǒng)通常包括一個前導序列（leader）、重復間隔序列以及CRISPR相關蛋白編碼基因（CRISPR associated genes，cas）。重復間隔序列是CRISPR結構最明顯的特征，由一段不連續(xù)的同向DNA重復序列（通常為24～47 bp）以及插入其中的間隔序列（通常為21～72 bp）組成。重復序列具有高度的保守性，多具有回文結構，體現(xiàn)細菌在進化中的保守性；間隔序列大多來源于外源可移動遺傳元件，如噬菌體、質(zhì)粒等，高度可變反映出多樣性[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，重復間隔序列、前導序列和cas基因之間存在共進化，構成一套保守而完整的系統(tǒng)，新間隔序列的插入往往伴隨著原有間隔序列的刪除，同時，CRISPR的進化與其所處的環(huán)境也有關[4]。

空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）是一種重要的食源性人畜共患病病原菌。空腸彎曲菌感染通常導致空腸彎曲菌腸炎，主要癥狀為細菌性腹瀉。目前在很多國家，它是引起人細菌性腹瀉的最重要原因之一。歐洲食品安全局報告指出，在歐盟該菌已連續(xù)多年成為導致食源性疾病病例最多的細菌[5]。根據(jù)美國疾控中心2016年度對美國食源性致病微生物引起發(fā)病人數(shù)的統(tǒng)計資料，空腸彎曲菌導致的病例數(shù)排名第一[6]。我國由于缺乏較為完整和系統(tǒng)的空腸彎曲菌流行病學數(shù)據(jù)，目前尚無法評估其確切的危害性?？漳c彎曲菌廣泛存在于家禽、家畜以及鳥類的腸道內(nèi)，在很多動物中屬于正常攜帶細菌，能夠通過食物鏈傳遞給人類，引起人類發(fā)病。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將空腸彎曲菌列為最常見的食源性病原菌之一。空腸彎曲菌污染的肉、奶、蛋以及水源等是目前已報道的空腸彎曲菌感染的主要來源。采用有效的分子分型方法對空腸彎曲菌進行分型，對于掌握空腸彎曲菌的污染分布規(guī)律，建立完善的溯源圖譜系統(tǒng)非常重要。本研究通過對在禽源中分離的86 株空腸彎曲菌進行CRISPR結構分析，統(tǒng)計重復序列和間隔序列數(shù)量信息，分析間隔序列與外源基因的同源性，以期能更好地理解空腸彎曲菌CRISPR結構特征與分布情況，為今后食源性空腸彎曲菌的溯源和控制提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空腸彎曲菌標準菌株（NCTC11168和ATCC49943）由江蘇出入境檢驗檢疫局饋贈。實驗用86株空腸彎曲菌菌株從江蘇地區(qū)禽肉中分離，詳細信息見表1。分離及鑒定方法參考GB 4789.9—2014《食品微生物學檢驗 空腸彎曲菌檢驗》[7]。鑒定過的菌株使用Wang’s保存液[8]保存于－70 ℃低溫冰箱中。

表1 空腸彎曲菌分離菌株信息Table 1 Information about C. jejuni strains used in this study

哥倫比亞血平板 英國Oxoid公司；綿羊全血 北京陸橋技術股份有限公司；微需氧產(chǎn)氣袋 法國梅里埃公司；細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技有限公司；DNA Marker DL-2000、DreamTaq Green聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix 美國Thermo公司。

1.2 儀器與設備

SD115恒溫培養(yǎng)箱 德國Binder公司；2X4ATT梯度PCR儀 德國Biometra公司；Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 提取細菌基因組DNA

配制哥倫比亞血平板，滅菌冷卻至50 ℃后添加5%的綿羊血混勻倒平板。將冷凍保藏的菌株接種到哥倫比亞血平板上，42 ℃微需氧環(huán)境下（5% O2，10% CO2，85% N2）進行培養(yǎng)，48 h后挑取單菌落劃線在哥倫比亞血平板上并培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的細菌菌落用無菌生理鹽水洗出收集，使用試劑盒方法提取基因組DNA。提取到的DNA樣品分裝后，－20 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 CRISPR引物設計

根據(jù)Price等[9]對210 株澳大利亞空腸彎曲菌和結腸彎曲菌CRISPR結構的研究報道，同時比對數(shù)據(jù)庫CRISPR database（http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/）公布的空腸彎曲菌CRISPR位點信息[10]，確定空腸彎曲菌CRISPR位點引物為：正向引物CRISPR-For（5’-GCAACCTCCTT TTAGTGGAGTAATTAG-3’），反向引物CRISPR-Rev（5’-AAGCGGTTTTAGGGGATTGTAAC-3’）。引物由上海生工生物工程技術公司有限公司合成。

1.3.3 CRISPR序列PCR擴增和測序

PCR條件：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，進行30 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。反應結束后，取3 μL產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。所得陽性結果送至上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序。

1.3.4 CRISPR序列分析及同源性比對1.3.4.1 CRISPR序列識別

測序結果采用SeqMan軟件進行拼接，拼接后的序列使用CRISPRs finder（http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/）進行分析[11]，結果可以得到確認的和存疑的兩種CRISPR結構，對于存疑的CRISPR結構，需進行人工比對。

1.3.4.2 重復序列二級結構預測

對完整CRISPR結構（至少包括2 個重復序列和1個間隔序列）的所有重復序列分別進行多序列比對，利用Weblogo（3.0版本，http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）進行序列保守性分析[12]。依據(jù)堿基頻率，使用RNAfold web server（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）分別預測其RNA二級結構。

1.3.4.3 間隔序列的同源性分析

通過CRISPR finder網(wǎng)站、CRISPR recognition tool（CRT）軟件和Mega 5.0多序列比對獲得每個CRISPR結構重復序列和間隔序列的信息[11,13]。將序列差異低于10%的兩個間隔序列，認為是相同序列[14]。對間隔序列進行多序列比對，去除重復的間隔序列。使用CRISPR Target（http://bioanalysis.otago.ac.nz/CRISPRTarget/crispr_analysis.html）對間隔序列的同源性進行分析，選擇的數(shù)據(jù)庫包含GenBank-Phage、RefSeq-Plasmid、RefSeq-Microbial和RefSeq-viral等，比對相關參數(shù)選擇默認值[15]，獲得間隔序列與外源基因的同源性信息。

2 結果與分析

2.1 88 株空腸彎曲菌的CRISPR結構檢測結果

以88 株空腸彎曲菌基因組DNA為模板，PCR擴增CRISPR片段，測序結果輸入CRISPRs finder分析查找CRISPR結構。結果顯示，經(jīng)過PCR擴增共有51 株細菌的基因組DNA擴增出片段產(chǎn)物。通過分析發(fā)現(xiàn)在51 個PCR產(chǎn)物中，有13 株對應的菌株未檢出任何確認的CRISPR結構，有32 個有確定的CRISPR結構，6 個有疑似的CRISPR結構，CRISPR檢出率為36%。

截止到2017年9月，CRISPRs database數(shù)據(jù)庫（http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/crispr/）共收錄111 株空腸彎曲菌全基因組序列，經(jīng)數(shù)據(jù)庫分析其中有50 株菌株含有確定的CRISPR結構，占總菌株數(shù)的45%[10]。其中2 株菌（C. jejuni OD267 GCF_001587015）被確定有2 個CRISPR結構（1個位于質(zhì)粒上），菌株（C. jejuni subsp. jejuni M129 GCF_001865595）的CRISPR結構只在質(zhì)粒上有1 個，其余菌株全基因組均只有1 個CRISPR結構且均位于染色體DNA上。在發(fā)現(xiàn)的CRISPR結構中單菌株CRISPR的長度為101～959 bp，最小間隔序列數(shù)量為1，最大間隔序列為14（表2）。

表2 空腸彎曲菌CRISPR結構統(tǒng)計信息Table 2 Information about CRISPRs of C. jejuni obtained in this study and from the database

本研究檢測空腸彎曲菌的CRISPR結構比率為36%，較數(shù)據(jù)庫略低。32 株菌株中每個菌株均只有1個CRISPR結構，其中CRISPR序列長度范圍在92～366 bp，重復序列長度范圍為27～37 bp，與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)接近（30～41 bp）。間隔序列數(shù)量為1～5 個，與參考數(shù)據(jù)庫相比波動小很多（表2）。

2.2 CRISPR的重復序列

在所發(fā)現(xiàn)的32 個CRISPR結構中共有4 種序列有差異的重復序列，但這4 種序列之間的差異僅僅是部分堿基突變導致的個別堿基差異，且差異都小于10%，因此將其視為相同序列。識別到的重復序列為5’-GTTTTAGTCC CTTTTTAAATTTCTTTATGGTAAAAT-3’。這條序列與空腸彎曲菌CRISPR數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)頻率最高的重復序列一致，因此本研究并未發(fā)現(xiàn)新的重復序列。經(jīng)weblogo在線分析所有重復序列（共145 條）的保守型（圖1）發(fā)現(xiàn)，在重復序列的起始端位點存在較多的變異，該重復序列在空腸彎曲菌的CRISPR結構中普遍存在，進一步驗證了重復序列具有高度的保守性[16]。有研究認為，重復序列可以轉錄且形成穩(wěn)定的RNA二級結構，這個現(xiàn)象在古菌中已被驗證[17-18]。使用RNAfold web server對本研究發(fā)現(xiàn)的重復序列進行二級結構預測，結果發(fā)現(xiàn)，該重復序列并不能形成較為穩(wěn)定的莖環(huán)結構。通常認為，大部分細菌的CRISPR結構的重復序列能形成較為穩(wěn)定的二級莖環(huán)結構，如嗜熱鏈球菌、志賀菌、嗜水氣單胞菌等[19-21]，但是，在近幾年的很多研究中也發(fā)現(xiàn)并不是所有的重復序列都能夠形成穩(wěn)定的二級結構[17,22-23]，有研究[17,24]對195 個微生物基因組中的CRISPR重復序列進行結構分析，根據(jù)重復序列能否形成穩(wěn)定的二級結構可以將CRISPR分為12 個大類，在細菌和古菌基因組中都存在不能形成穩(wěn)定二級結構的類群，他們發(fā)揮作用可能是依賴其序列的特異性和特異性蛋白相互作用來實現(xiàn)的，而該特性已在古菌Sulfolobus的CRISPR結構中得到驗證[23]。

圖1 重復序列的堿基頻率分析圖Fig. 1 Base frequency of the direct repeats

2.3 CRISPR的間隔序列及來源分析

CRISPR Finder識別到的間隔序列共有111 條，序列相似性分析顯示共包括17 種不同類型的間隔序列，有10 種類型的間隔序列與CRISPR數(shù)據(jù)庫中公布的一致；有7 種間隔序列為新發(fā)現(xiàn)的間隔序列，共55 條，占總間隔序列的49.5%，目前空腸彎曲菌CRISPR數(shù)據(jù)庫中信息還是比較有限，本研究將為空腸彎曲菌CRISPR結構的進化和功能機制研究提供更豐富的信息。

之前的研究已經(jīng)揭示了細菌CRISPR結構的間隔序列與噬菌體、質(zhì)粒等外源基因組，以及同一細菌基因組的其他部分具有高度同源性[25-26]，因此本研究將在空腸彎曲菌中發(fā)現(xiàn)的111 條間隔序列與GenBank-Phage、RefSeq-Plasmid、RefSeq-Microbial和RefSeq-viral 4 個數(shù)據(jù)庫中的序列進行了BLAST比對分析。表3結果顯示，有57 個間隔序列與質(zhì)粒或噬菌體序列具有同源性片段，其中有9 個間隔序列與彎曲菌的噬菌體具有高度同源性，23 個間隔序列與彎曲菌攜帶的質(zhì)粒高度同源。這一現(xiàn)象充分證實了細菌通過CRISPR獲得免疫能力的機制：彎曲菌在抵御外源質(zhì)?；蚴删w時，將該相應的外源片段整合到自身的CRISPR結構，形成自身免疫機制。另外，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)有24 個間隔序列與食源性致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌攜帶質(zhì)粒存在同源性，產(chǎn)氣莢膜梭菌也是一類較為常見的食源性致病菌[27]，且常存在于禽類動物的腸道中，與空腸彎曲菌的生存環(huán)境相似[28]，這一現(xiàn)象表明，動物腸道環(huán)境為致病菌之間的信息交流提供了場所和條件，外源質(zhì)粒在這一環(huán)境中存在基因的水平轉移。另外，還發(fā)現(xiàn)一個間隔序列比對結果與弧菌噬菌體具有同源性，弧菌科與彎曲菌科親緣關系較近，可能存在弧菌噬菌體同樣能夠侵染彎曲菌的現(xiàn)象，這種基因水平轉移現(xiàn)象在許多細菌CRISPR結構中都被發(fā)現(xiàn)[29-30]，這也是CRISPR系統(tǒng)限制細菌間的水平基因轉移，幫助細菌防御噬菌體侵染的有利途徑。

表3 間隔序列同源比對結果Table 3 Homologous spacers from plasmids or phages

2.4 不同來源的空腸彎曲菌CRISPR位點比較分析

已有研究認為，CRISPR結構的差異可作為細菌分型的一項指標[3,31]。88 株空腸彎曲菌中，包含確定的CRISPR結構的菌株32 株，疑似CRISPR結構的菌株6 株。由于疑似CRISPR結構在一定程度上代表了在該CRISPR座位上的結構特征，有可能會為菌株的分型提供更多的信息，因此將疑似CRISPR結構與確定的CRISPR結構合并進行分析。根據(jù)CRISPR位點間隔序列的多樣性，共組成了7 種不同的CRISPR譜型（圖2）。通過CRISPR位點分布圖發(fā)現(xiàn)，所測菌株大部分分布在C譜型，與標準菌株NCTC11168和ATCC49943相比較有較大差異。NCTC11168分離自人體腹瀉樣本[32]，本次檢測到的CRISPR結構與以往報道一致，該菌株含有一個由5 個重復序列和4 個間隔序列構成的CRISPR[33]，可能由于其分離環(huán)境與本研究菌株不同，菌株獲得的外源序列有所不同；標準菌株ATCC49943也檢測到由5 個重復序列和4 個間隔序列構成的CRISPR，然而其間隔序列與NCTC11168所含有的間隔序列完全不同，值得指出的是，與本實驗室菌株的主要譜型（C譜型）相比，菌株ATCC49943的第1個間隔序列和最后1個間隔序列與C譜型完全相同，而中間第2、3個間隔序列與C譜型不同，這可能暗示著空腸彎曲菌CRISPR結構在不斷進化的過程中伴隨著間隔序列的刪除和插入[16]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)在所有空腸彎曲菌CRISPR結構中，間隔序列Sp8在B、C、E 3個譜型中都出現(xiàn)，且均在空腸彎曲菌CRISPR結構的末端，表明該間隔序列可能在空腸彎曲菌中存在一定的普遍性和保守性。

圖2 38 株空腸彎曲菌CRISPR結構分布圖Fig. 2 CRISPR structure distribution of 38 strains of C. jejuni

86 株野生分離株中，其中分離自江蘇南京養(yǎng)殖場的鴨源空腸彎曲菌（Cj 1～19）CRISPR結構分布比率最高（68.4%），而且主要都在C譜型中，僅Cj 1屬于E譜型，且僅含有2個間隔序列（圖2）。分離自江蘇南京養(yǎng)殖場的雞源空腸彎曲菌（Cj 20～65）中共檢測到17 個CRISPR結構，主要分布在C、D、F和G譜型中，其中以C譜型和D譜型結構較多（圖2）。從江蘇蘇州活禽市場和零售雞肉中分離到的空腸彎曲菌所檢測到的CRISPR結構比率相對較低，從活禽市場樣品中檢測到的CRISPR結構主要為D譜型和G譜型。而零售雞肉中分離到的6 株空腸彎曲菌菌株僅1 株檢測到CRISPR結構，結構為G譜型（圖2）。以上結果表明，不同樣品來源分離得到的空腸彎曲菌在CRISPR結構比率和譜型上差距較大，間隔序列排列方式和序列差異性也較為顯著，表明CRISPR結構在細菌分型和溯源上的巨大潛力。目前CRISPR已經(jīng)被成功應用于沙門菌[34]、大腸桿菌[35-36]、布氏乳桿菌[37]等的分型中，但對空腸彎曲菌的CRISPR信息了解甚少[38-39]。本研究為空腸彎曲菌的CRISPR結構提供了序列信息，對其CRISPR譜型的研究為后續(xù)分型和溯源研究奠定了數(shù)據(jù)基礎，然而，本研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR結構在空腸彎曲菌中的存在率較低（36%），根據(jù)報道，其在細菌中的存在率為40%左右[2]，其較低的存在率極大地限制了CRISPR分型的普適性。與傳統(tǒng)的分子分型方法，如：脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE），多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）等相比，基于細菌全基因組的PFGE分型方法和基于細菌管家基因序列差異性的MLST分型方法則不存在該限制。但是，CRISPR結構檢測、數(shù)據(jù)處理和分析程序方面相較于PFGE、MLST等方法簡化了很多，且由于CRISPR本身的特點，間接序列攜帶的外源基因片段反映了其遺傳進化過程中的軌跡，更能區(qū)分同一物種下的細微差異。因此，對含有CRISPR結構的菌株進行進一步分型可以更好地完善和補充現(xiàn)有分型方法的不足。

3 結 論

本研究對江蘇地區(qū)分離的86株空腸彎曲菌野毒株進行CRISPR結構的檢測和生物信息學分析，通過攜帶CRISPR結構的特征，對空腸彎曲菌進行了CRISPR分型的研究探索。88 株空腸彎曲菌（含標準菌株2 株）中，36%的菌株中含有確定的CRISPR結構（43%含疑似CRISPR結構），且菌株均只含有1個CRISPR結構。檢測到的111 條間隔序列根據(jù)其序列的差異性可分為17 種類型，其中7 種為首次發(fā)現(xiàn)的間隔序列。間隔序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，菌株中的間隔序列多來源于彎曲菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和弧菌攜帶的質(zhì)粒，以及噬菌體。根據(jù)CRISPR結構差異，本研究將檢出CRISPR結構的38 株菌株分為7 個CRISPR譜型，不同樣品來源分離得到的空腸彎曲菌在CRISPR結構比率和譜型上差距較大，間隔序列排列方式在不同譜型之間存在一定的保守性，其序列差異性也表明了CRISPR結構在不斷進化過程中存在序列的刪除和插入。本研究表明CRISPR結構在空腸彎曲菌分型和溯源上的潛力，但并不是所有空腸彎曲菌中都存在CRISPR結構，采用CRISPR結構分析與其他分子分型（如MLST、PFGE等）相結合的方法進行分子分型可能是未來空腸彎曲菌分子分型的一個發(fā)展方向。