趙超敏，王敏，張潤何，鄧曉軍，房克艷,2

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135）（2.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

近年來牛乳制品食品安全問題時(shí)有發(fā)生，對(duì)人們健康構(gòu)成威脅，并會(huì)造成國家嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)恐慌，也使消費(fèi)者對(duì)牛乳制品的安全提出更高的要求，食用純天然、無污染、高品質(zhì)的牛乳制品，已經(jīng)成為廣大消費(fèi)者的共識(shí)。有機(jī)乳制品這種純天然、高品質(zhì)的環(huán)保健康食品就應(yīng)運(yùn)而生。消費(fèi)者對(duì)所購買產(chǎn)品的真實(shí)屬性關(guān)注越來越高，消費(fèi)者愿意花高價(jià)去購買這些質(zhì)量得到承諾的產(chǎn)品（如有機(jī)乳制品），因此，有機(jī)乳制品的市場需求不斷增加。由于有機(jī)乳制品是一種純天然、高品質(zhì)的環(huán)保健康食品，其價(jià)格高于普通乳制品，國外有機(jī)乳制品的價(jià)格高出普通乳制品約20%～40%，國內(nèi)有機(jī)乳制品價(jià)格也高出普通乳制品的2～3倍。在高昂利益驅(qū)使下，市場上會(huì)有有機(jī)乳制品欺詐和不法行為風(fēng)險(xiǎn)的存在，如標(biāo)簽混亂、普通乳制品貼牌冒充有機(jī)乳制品、復(fù)原乳冒充新鮮純有機(jī)乳、以次充好、摻假等欺詐行為。目前，對(duì)于有機(jī)產(chǎn)品我國雖然制定了相關(guān)規(guī)定（GB/T 19630），但是有機(jī)乳制品認(rèn)證管理也有時(shí)存在漏洞，有機(jī)乳制品可追溯信息不全、有機(jī)認(rèn)證資料缺失或偽造等，僅靠產(chǎn)品的有機(jī)認(rèn)證信息難以保證有機(jī)乳制品的真實(shí)性。目前，國內(nèi)外沒有明確的檢測技術(shù)可以精準(zhǔn)鑒別有機(jī)乳制品，難以采取有效的控制或防范措施。

穩(wěn)定同位素比值溯源是國際上目前用于追溯不同來源食品、實(shí)施產(chǎn)地保護(hù)和鑒別食品中物質(zhì)摻假的一種有效工具，并已成功應(yīng)用于蜂蜜[1～3]、果汁[4～6]、葡萄酒[7,8]、油脂[9]等食品的鑒別，以及肉品產(chǎn)地溯源和肉品成分物質(zhì)與飼料的關(guān)系[10,11]。已有研究者應(yīng)用穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)于有機(jī)產(chǎn)品的鑒別，如鑒別有機(jī)牛肉[12]、有機(jī)奶[13,14]。有機(jī)放牧和普通飼養(yǎng)方式不同，其喂養(yǎng)奶牛的飼料和生長環(huán)境有明顯的差異性，這種差異性使得生產(chǎn)的牛乳穩(wěn)定同位素的豐度比（如13C/12C、15N/14N等）不同，雖然同位素比組成受動(dòng)物代謝過程中同位素分餾的影響，但是主要由動(dòng)物飼養(yǎng)的營養(yǎng)物和環(huán)境決定。目前研究表明，通過穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)鑒別有機(jī)乳制品可能會(huì)成為國際趨勢。本實(shí)驗(yàn)對(duì)有機(jī)奶粉的碳、氮穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行測定研究，探索不同來源乳制品的差異性。

1 材料與方法

1.1 儀器與耗材

Delta V同位素比質(zhì)譜儀，配Flash 2000元素分析儀，購自美國Thermo Fisher公司；XPE26C微量分析天平，購自瑞士MettlerToledo公司；錫杯（9 mm×5 mm），購自美國Thermo Fisher公司；CHN反應(yīng)管，購自美國 Thermo Fisher公司；氦氣（載氣，純度＞99.999%），購自上海尤嘉利液氦有限公司；氧氣（純度≥99.9992%）、二氧化碳和氮?dú)猓▍⒖細(xì)?，純度?9.9995%），均購自北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司；IAEA600 咖啡因（δ13C=-27.771‰，δ15N=1‰），購自國際原子能機(jī)構(gòu)，作為參考?xì)庑?zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)物。

1.2 樣品

出入境法定監(jiān)管樣品。共收集3個(gè)品牌有機(jī)奶粉和非有機(jī)奶粉，編號(hào)分別為 1、2、3。根據(jù)產(chǎn)品信息不同，1號(hào)品牌有機(jī)奶粉共6份，編號(hào)為1A1～1A6，非有機(jī)奶粉2份，編號(hào)為1B1～1B2；2號(hào)品牌有機(jī)奶粉和非有機(jī)奶粉各一份，編號(hào)分別為2A1和2B2。3號(hào)品牌有機(jī)奶粉和非有機(jī)奶粉各 20份，編號(hào)分別為3A1～3A20 和3B1～3B20。

1.3 儀器參數(shù)

1.3.1 元素分析儀參數(shù)

氧化爐溫度：980 ℃；柱溫：50 ℃；載氣（氦氣）流速：100 mL/min；氧氣流速：175 mL/min；吹掃氣（氦氣）180 mL/min；注氧時(shí)間：3 s。

1.3.2 同位素比質(zhì)譜儀參數(shù)

離子化方式：EI離子源。離子源電壓：3.07 kV。真空度：1.6×10-6mBar。氦氣壓力：4 bar。氧氣壓力：4 bar。二氧化碳?jí)毫Γ? bar。氮?dú)鈮毫Γ? bar。空氣壓力：8 bar。

1.4 樣品制備

碳穩(wěn)定同位素比值測定：將試樣混勻，稱取樣品70～100 μg于錫杯中，密封包裹成球，每個(gè)樣品重復(fù)制備6平行，待測。

氮穩(wěn)定同位素比值測定：將試樣混勻，稱取樣品4000～5000 μg于錫杯中，密封包裹成球，每個(gè)樣品重復(fù)制備6平行，待測。

1.5 數(shù)據(jù)處理

元素分析-同位素比質(zhì)譜（EA-IRMS）分析結(jié)果以δ表示，它反應(yīng)了樣品和國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)之間同位素豐度比的相對(duì)差異：

其中：R代表13C/12C或15N/14N同位素含量比，SPL與STD分別代表“樣品”和“標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”，δ值用千分?jǐn)?shù)表示(‰)。樣品結(jié)果允許標(biāo)準(zhǔn)偏差為＜0.3‰。

1.6 分析方法評(píng)價(jià)

分析方法的靈敏度、精密度、系統(tǒng)的穩(wěn)定性直接決定樣品δ值的準(zhǔn)確性，因此，通過評(píng)價(jià)方法靈敏度、穩(wěn)定性、精密度對(duì)方法的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳氮穩(wěn)定同位素比值分析

對(duì)比分析了三種品牌有機(jī)奶粉和非有機(jī)奶粉的δ13C值和δ15N值（表1），由結(jié)果可知，有機(jī)奶粉的δ13C在-28.55‰與-25.76‰之間，δ15N 值在 4.51‰～5.35‰之間，非有機(jī)奶粉的δ13C在-27.89‰與-19.39‰之間，δ15N值在4.04‰～6.67‰之間，雖然有機(jī)與非有機(jī)樣品的數(shù)據(jù)范圍有部分交叉，但是整體有機(jī)奶粉的δ13C和δ15N值與非有機(jī)奶粉的δ13C和δ15N值具有差異性（單因素方差分析p＜0.05），有機(jī)奶粉δ13C值的整體趨勢比非有機(jī)奶粉的δ13C值更偏負(fù)，這也與有關(guān)研究者結(jié)論相似[14]，有機(jī)奶粉δ15N值的整體趨勢比非有機(jī)奶粉的δ15N值稍低，這也被其他研究者證實(shí)[13]，有機(jī)奶粉和非有機(jī)奶粉δ13C和δ15N值的數(shù)據(jù)范圍交叉可能與樣品性質(zhì)有關(guān)，因?yàn)樗x取樣品均為配方奶粉，樣品基質(zhì)中存在其他含有C、N元素的物質(zhì)對(duì)結(jié)果造成了影響，使得有機(jī)和非有機(jī)的數(shù)據(jù)范圍界限不明確，但是從結(jié)果說明穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜方法可以作為鑒別物質(zhì)質(zhì)量屬性的一種有效工具。

δ13C值取決于動(dòng)物不同植物來源營養(yǎng)物質(zhì)中的碳穩(wěn)定同位素，如C3（如干草、小麥、大豆等）植物和C4植物（如玉米、甘蔗等）。植物的δ13C值與光合作用方式相關(guān)，C3植物δ13C值變化范圍為-23‰至-35‰之間，C4植物分布范圍則為-9‰至-19‰之間[14]。有機(jī)奶粉主要以有機(jī)奶組成，出自有機(jī)牧場，有機(jī)牧場幾乎完全由C3植物組成，而非有機(jī)奶粉主要以普通奶為原料，來自圈養(yǎng)的養(yǎng)殖場，飼料多以C4植物為主，因此，這就是有機(jī)奶粉比非有機(jī)奶粉δ13C值偏負(fù)的原因。

有機(jī)牧場禁止使用人造肥料，牛乳中氮同位素比取決于土壤中有機(jī)氮，人造肥料一般通過大氣中的氮?dú)鈦砩a(chǎn)，相比之下，有機(jī)肥料含有相對(duì)較多的重15N。由于受飼料組成、土壤特點(diǎn)和肥料類型多因素的影響，有機(jī)和非有機(jī)產(chǎn)品δ15N值的區(qū)別稍小。

表1 有機(jī)奶粉和非有機(jī)奶粉δ13C和δ15N值對(duì)比（n=6）Table 1 The δ13C and δ15N in organic milk powder and conventional milk powder (n=6)

2.2 系統(tǒng)穩(wěn)定性

系統(tǒng)的穩(wěn)定性通過脈沖進(jìn)入離子源的 CO2或 N2參考?xì)鈦砜刂?，碳同位素和氮同位素比值穩(wěn)定，且SD＜0.06，每次測樣前必須檢查系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

樣品測定值的穩(wěn)定性通過每次樣品序列前和序列中穿插咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品測定來評(píng)估，每次至少測定6平行。標(biāo)準(zhǔn)值δ13C=-27.771‰與δ15N=1‰，測定值與標(biāo)準(zhǔn)值必須SD＜0.3‰，否則系統(tǒng)穩(wěn)定性差影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需重新檢查儀器系統(tǒng)。

2.3 靈敏度

靈敏度通過樣品不同進(jìn)樣量的測定值及其信號(hào)強(qiáng)度來評(píng)價(jià)分析。選擇1號(hào)樣品1A3作為評(píng)估樣，選擇進(jìn)樣范圍為50～150 μg評(píng)估，當(dāng)進(jìn)樣量小于70 μg時(shí)，δ13C測定值穩(wěn)定性差，SD＞0.5‰，當(dāng)進(jìn)樣量高達(dá)140～150 μg時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度太大，氧化管銅絲消耗快，成本高，經(jīng)優(yōu)化選擇進(jìn)樣量為70～100 μg，此時(shí)δ13C平均值穩(wěn)定在-28.08‰±0.15‰附近，對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度在2500～6000 mV之間。因?yàn)闃悠分械睾康?，因此，分析氮同位素比值時(shí)，需要增加進(jìn)樣量，選擇進(jìn)樣范圍為2～7 mg，當(dāng)進(jìn)樣量小于4 mg時(shí)，測定值穩(wěn)定性差，SD＞0.5‰，當(dāng)進(jìn)樣量在6～7 mg時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度太大，此時(shí)因?yàn)樗治鲞M(jìn)樣中含更高碳元素，氧化管銅絲消耗更快，更換更頻繁，因此，選擇進(jìn)樣量為4～5 mg，此時(shí)δ15N平均值穩(wěn)定在4.72‰±0.11‰附近，對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度在5000～7000 mV之間。為進(jìn)一步提高δ15N值測定靈敏度，減少稱樣量，可去除碳元素含量過高的影響，把除水阱中高氯酸鎂換為二氧化碳吸附劑，但是這樣在測定δ13C和δ15N時(shí)需更換相應(yīng)的除水阱填充劑，比較繁瑣耗時(shí)。

2.4 精密度

日內(nèi)精密度通過隨機(jī)選取2個(gè)樣品，在同一天內(nèi)平行測定6次，分析其標(biāo)準(zhǔn)偏差SD。結(jié)果如表2所示，δ13C和δ15N測定值的SD值均小于0.3‰，咖啡因的δ13C和δ15N平均值分別為-27.79‰與0.98‰，SD值均小于 0.3‰，說明該方法的準(zhǔn)確性好，日內(nèi)精密度滿足試驗(yàn)分析要求。

表2 樣品δ13C和δ15N平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 The average value and SD of δ13C, δ15N of samples (n=6)

日間精密度通過任意選取2個(gè)樣品，連續(xù)測定5 d，每個(gè)樣平行測定6次，計(jì)算平均值及SD值（n=30）。如表3所示所有樣品的SD值均小于0.3‰，質(zhì)控樣的測定值與標(biāo)準(zhǔn)值接近，也顯示準(zhǔn)確性好，因此，該方法具有良好的日間精密度。

表3 樣品δ13C和δ15N平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 The average value and SD of δ13C, δ15N of samples (n=30)

3 結(jié)論

利用元素分析-同位素比質(zhì)譜法對(duì)有機(jī)奶粉和非有機(jī)奶粉的碳、氮穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行初步研究，有機(jī)奶粉的碳穩(wěn)定同位素比值較非有機(jī)奶粉的碳穩(wěn)定同位素比值更偏負(fù)，有機(jī)奶粉的氮穩(wěn)定同位素比值比非有機(jī)奶粉的氮穩(wěn)定同位素比值較接近，但稍低。這主要是與奶粉主要成份奶源有關(guān)系，因?yàn)橛袡C(jī)奶粉的主要原料來自有機(jī)牧場，有機(jī)牧場飼料主要為C3植物且不使用人造肥料。通過實(shí)驗(yàn)可知，δ13C和δ15N可能有助于鑒別有機(jī)產(chǎn)品的真實(shí)性，同位素比質(zhì)譜技術(shù)也可能是一個(gè)很好的鑒別物質(zhì)真實(shí)屬性的可靠技術(shù)，因奶粉產(chǎn)品中成分復(fù)雜，存在其他影響δ13C和δ15N值精準(zhǔn)性的碳、氮元素，因此，后續(xù)工作可研究純液態(tài)奶，使得區(qū)別有機(jī)奶與非有機(jī)奶δ13C和δ15N數(shù)據(jù)范圍更精準(zhǔn)、可靠。