黃浩，鄭紅發(fā)，趙熙，鐘妮,，余鵬輝,，黃建安，劉仲華

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，湖南長沙 410125）（2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，湖南長沙410128）（3.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128）

茯茶中的優(yōu)勢真菌-冠突散囊菌[1～3]，俗稱“金花”菌，一直被視作衡量茯茶品質(zhì)的重要指標(biāo)?，F(xiàn)行研究已從茯茶品質(zhì)化學(xué)[4]與功能成分化學(xué)[5～7]角度證實(shí)了冠突散囊菌對茯茶的重要性。課題組曾借助人工接種冠突散囊菌至茶葉固體發(fā)酵-“散茶發(fā)花”技術(shù)對不同茶類原料“發(fā)花”茯茶加工過程中的水浸出物、茶多酚、兒茶素組分、氨基酸、黃酮類、可溶性糖和可溶性蛋白等茶葉常量成分進(jìn)行含量檢測與分析，并考察加工各階段微生物及優(yōu)勢真菌的動態(tài)變化，其已基本探明茯茶的品質(zhì)風(fēng)味形成機(jī)理[8,9]。然而，茶是一種較為復(fù)雜的基質(zhì)，其生化成分因產(chǎn)地、品種而異。因此，在特定的載體中加入規(guī)定的介質(zhì)對更進(jìn)一步研究微生物對茶葉單一生化成分的代謝機(jī)制具有重要的意義[10]。王小剛[11]等人用黑曲霉等5種微生物分別接種綠茶和紅茶的干茶與茶湯的發(fā)酵體系（32 d）來考察咖啡堿的含量變化，結(jié)果表明不同生長基質(zhì)的同種真菌發(fā)酵體系對咖啡堿的含量產(chǎn)生較大差異。

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計已知、固定的培養(yǎng)基作為滿足冠突散囊菌生長需要的特定基質(zhì)，并以高純度咖啡堿、可可堿和茶堿作為冠突散囊菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的唯一外源添加底物，考察冠突散囊菌對上述3種單體成分為期10 d的發(fā)酵特性，為進(jìn)一步豐富茯茶品質(zhì)形成機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“金花”菌-冠突散囊菌（Eurotium cristatum），為本實(shí)驗室自藏菌株[12]，分離自益陽茶廠股份有限公司產(chǎn)茯磚茶（800 g裝，產(chǎn)于2007年）。

冠突散囊菌分離、純化培養(yǎng)基：PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）、察氏等固體培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基：1.0%（m/V）葡萄糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.1%（m/V）蛋白胨，北京生工生物工程有限公司；0.05%（m/V）檸檬酸，成都市科龍化工試劑廠；2%（V/V）Vogel’s N[13]（Vogel，1964）、0.015%（V/V）吐溫 80，中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；校準(zhǔn)pH 5.5。

馬鈴薯提取物，上海一研生物科技；葡萄糖（食品級），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉，北京振泰生物；咖啡堿（純度≥99%）、可可堿（純度≥95%）、茶堿（純度≥99%）。葡萄糖試劑盒、蛋白質(zhì)含量檢測試劑盒，南京建程生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Delta 320 pH計，Mettler；Motic B1光學(xué)顯微鏡，Motic公司；萬分之一電子天平，Mettler AE240；MIKRO-35 高速冷凍離心機(jī)，德國產(chǎn)；蘇凈超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司；振蕩式恒溫培養(yǎng)箱，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，江蘇環(huán)保儀器廠；高溫高壓滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠；恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗設(shè)備公司；10 mL一次性注射器，河南曙光健士醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司；0.22 μm過濾頭，Millipore；定量濾紙，杭州特種紙業(yè)有限公司；多功能酶標(biāo)儀，Thermo；96孔板，海門博陽實(shí)驗器材廠；7.5 cm玻璃漏斗、50 mL三角瓶、隔菌封口膜、10 mL、1.5 mL 離心管、1000 μL、200 μL Tip 頭，上海生工生物工程有限公司等。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 種子液培養(yǎng)

將預(yù)先培養(yǎng)5 d的斜面冠突散囊菌菌種轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基（200 mL）中，置振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)與取樣

從種子液中吸取4%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加過濾除菌的 Caffeine母液終濃度 0.2 mg/mL（Caffeine組）、可可堿母液終濃度0.08 mg/mL（Theobromine組）、茶堿母液終濃度 0.08 mg/mL（Theophylline組），未添加單體的培養(yǎng)基為Caffeine空白對照（F-wC組）、Theobromine空白對照（F-wTheob組）、Theophylline空白對照組（F-wTheop組），以及設(shè)置添加單體但未接種冠突散囊菌的空白對照（C-wF）、（Theob-wF）、（Theop-wF）；在溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下震蕩培養(yǎng)10 d；每24 h取樣觀察，三組發(fā)酵培養(yǎng)液均經(jīng)過濾處理，得到濾液和菌絲體，測定菌體干重和發(fā)酵清液的pH值，剩余葡萄糖含量，總蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 HPLC法分析咖啡堿、可可堿、茶堿在發(fā)酵液中的代謝情況

采用HPLC方法來定量分析底物咖啡堿、可可堿、茶堿在發(fā)酵過程中的消耗情況，反應(yīng)液原液稀釋至合適倍數(shù)后經(jīng)HPLC進(jìn)樣分析，三種生物堿的定量檢測方法采用色譜條件[14,15]：C18柱（4.6×200 mm，5 μm，welchrom），流動相：A：去離子水，B：N, N-二甲基甲酰胺：甲醇：乙酸=40：2：1.5，流速：1 mL/min。進(jìn)樣量：10 μL等條件在278 nm下檢測，試驗重復(fù)六次（n=6），分析并計算結(jié)果。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用數(shù)學(xué)統(tǒng)計分析軟件SPSS 19.0進(jìn)行檢驗分析，試驗重復(fù)三次并取 3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌-咖啡堿共培養(yǎng)發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)物含量的變化

HPLC方法對添加咖啡堿的發(fā)酵液進(jìn)行含量檢測分析，圖1結(jié)果顯示為期10 d的發(fā)酵對發(fā)酵液中咖啡堿的含量變化無明顯影響，這意味著以發(fā)酵液中的咖啡堿不能被冠突散囊菌生長繁殖所直接利用，這可能與咖啡堿較穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)相關(guān)。

圖1 HPLC法檢測發(fā)酵液中咖啡堿的含量Fig.1 The content of caffeine in the fermentation broth was detected by HPLC

2.2 冠突散囊菌-咖啡堿共培養(yǎng)發(fā)酵體系的理化特性

圖2結(jié)果顯示咖啡堿組發(fā)酵液的pH值隨著發(fā)酵時間的增加持續(xù)下降，發(fā)酵前 6～7 d，咖啡堿組與未加咖啡堿組變化趨勢表現(xiàn)出高度一致，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入第7 d，咖啡堿組pH值下降的幅度逐漸增大直至第9 d趨于穩(wěn)定，這可能是咖啡堿刺激菌體生長加速菌體代謝出有機(jī)酸，同時延緩了菌體自溶，進(jìn)而導(dǎo)致延緩了發(fā)酵液pH值上升?？偟脕碚f，咖啡堿組菌體生物量增加并不明顯，這可能與咖啡堿的穩(wěn)定性質(zhì)而不易被菌體所利用有關(guān)。

兩組發(fā)酵液中剩余葡萄糖含量的變化趨勢一致，相比之下，添加咖啡堿的發(fā)酵液中葡萄糖的含量下降的更為明顯，說明有咖啡堿的存在可能對刺激菌體的生長繁殖存在積極作用，從而加速冠突散囊菌對發(fā)酵液中葡萄糖的消耗；二組發(fā)酵液總蛋白質(zhì)含量都隨著發(fā)酵時間的增加而逐漸升高，而又分別在發(fā)酵第8、9 d相繼開始下降，一方面冠突散囊菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中胞外酶的分泌和積累，另一方面，也可能是由于菌體自溶導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白等大分子物質(zhì)快速降解。

圖2 冠突散囊菌-咖啡堿共培養(yǎng)發(fā)酵體系的理化特性Fig.2 The physical and chemical characteristics of the co-culture fermentation system of Eurotium cristatum-caffeine

2.3 冠突散囊菌-可可堿共培養(yǎng)發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)物含量的變化

圖3 HPLC法檢測發(fā)酵液中可可堿及其發(fā)酵產(chǎn)物的含量Fig.3 The content of theobromine and its fermentation products in the fermentation broth was detected by HPLC

采用HPLC方法對添加可可堿的發(fā)酵液進(jìn)行含量檢測分析，結(jié)果顯示為期10 d的發(fā)酵對發(fā)酵液中可可堿的含量變化無明顯影響，這意味著發(fā)酵液中的可可堿可能不能被冠突散囊菌生長繁殖所直接利用，這可能與咖啡堿較穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，由圖3可知，發(fā)酵結(jié)束時在發(fā)酵液中能檢測到少量的咖啡堿，這說明冠突散囊菌可能能以可可堿為前提合成咖啡堿。

2.4 冠突散囊菌-可可堿共培養(yǎng)發(fā)酵體系的理化特性

由圖4可知，可可堿添加組發(fā)酵液的pH值隨著發(fā)酵時間的增加持續(xù)下降，從發(fā)酵開始到結(jié)束，兩組變化趨勢表現(xiàn)出高度一致，菌體生長繁殖將碳源轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸而導(dǎo)致發(fā)酵液pH值持續(xù)下降，直至第8 d趨于穩(wěn)定。

二組菌體生物量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，添加可可堿與未添加可可堿對照相比，其菌體生物量要稍高于后者，說明可可堿的添加對菌體生長有促進(jìn)作用。發(fā)酵進(jìn)入第8 d，菌體生物量開始下降，對照pH值曲線，這可能是因為菌體開始自溶所致。

添加可可堿的發(fā)酵液與未添加咖啡堿對照組發(fā)酵液中剩余葡萄糖含量的變化趨勢一致，相比之下，添加可可堿的發(fā)酵液中葡萄糖的含量下降的更為明顯，說明有可可堿的存在可能對刺激菌體的生長繁殖存在積極作用，從而加速冠突散囊菌對發(fā)酵液中葡萄糖的消耗；二組發(fā)酵液總蛋白質(zhì)含量均隨著時間的增加而逐漸升高，而又分別在發(fā)酵第8、9 d相繼開始下降，一方面冠突散囊菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中胞外酶的分泌和積累，另一方面，也可能是由于菌體自溶導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白等大分子物質(zhì)快速降解。

圖4 冠突散囊菌-可可堿共培養(yǎng)發(fā)酵體系的理化特性Fig.4 The physical and chemical characteristics of the co-culture fermentation system of Eurotium cristatum-theobromine

2.5 冠突散囊菌-茶堿共培養(yǎng)發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)物含量的變化

采用HPLC方法對添加茶堿的發(fā)酵液進(jìn)行含量檢測分析，圖5結(jié)果顯示為期10 d的發(fā)酵對發(fā)酵液中茶堿的含量變化無明顯影響，這意味著發(fā)酵液中的茶堿不能被冠突散囊菌生長繁殖直接利用；由圖5-K可知，發(fā)酵結(jié)束時在發(fā)酵液中能檢測到少量的咖啡堿，這說明冠突散囊菌可能以茶堿為底物合成咖啡堿。

圖5 HPLC法檢測發(fā)酵液中茶堿及其發(fā)酵產(chǎn)物的含量Fig.5 The content of theophylline and its fermentation productsin the fermentation broth was detected by HPLC

2.6 冠突散囊菌-茶堿共培養(yǎng)發(fā)酵體系的理化特性

圖6結(jié)果顯示茶堿組發(fā)酵液的pH值隨著發(fā)酵時間的增加持續(xù)下降，從發(fā)酵開始到發(fā)酵結(jié)束，茶堿組與未加茶堿組變化趨勢表現(xiàn)出高度一致，菌體生長繁殖將碳源轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸而導(dǎo)致發(fā)酵液pH值持續(xù)下降，直至第8 d趨于穩(wěn)定。

二組菌體生物量均呈現(xiàn)增加的趨勢，添加茶堿與未添加茶堿對照比相比，其菌體生物量前者要稍高于后者，說明茶堿能刺激菌體生長。發(fā)酵進(jìn)入第8 d，菌體量開始下降，對照pH值曲線，這可能是由于菌體自溶所引起的。

兩組發(fā)酵液中剩余葡萄糖含量的變化趨勢一致，添加茶堿的發(fā)酵液中葡萄糖的含量下降的更為明顯，說明有茶堿的存在可能對刺激菌體的生長繁殖存在積極作用，從而加速冠突散囊菌對發(fā)酵液中葡萄糖的消耗；二組發(fā)酵液總蛋白質(zhì)含量都隨著時間的增加而逐漸升高，而又分別在發(fā)酵第8、9 d相繼開始下降，一方面冠突散囊菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中胞外酶的分泌和積累，另一方面，也可能是由于菌體自溶導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白等大分子物質(zhì)快速降解。

圖6 冠突散囊菌-茶堿共培養(yǎng)發(fā)酵體系的理化特性Fig.6 The physical and chemical characteristics of the co-culture fermentation system of Eurotium cristatum-theophylline

3 結(jié)論

3.1 茯茶中的“金花”菌（冠突散囊菌）之所以能生長繁殖是因為茶葉能為“金花”菌的生長繁殖提供必需的碳源、氮源，一方面，“金花”菌直接利用簡單含碳、氮化合物進(jìn)行生長繁殖，另一方面，“金花”菌分泌的孢外酶作用于茶葉內(nèi)含成分發(fā)生一系列生化反應(yīng)，間接的為該菌的生長繁殖提供營養(yǎng)基礎(chǔ)?！吧⒉璋l(fā)花”技術(shù)[16]是在傳統(tǒng)茯磚茶加工工藝基礎(chǔ)上的創(chuàng)新與升級，其獨(dú)特之處在于較大地縮短了加工周期，從壓制到出烘由傳統(tǒng)的1個月的時間縮短至1周左右，且利用該技術(shù)加工的茯茶新產(chǎn)品品質(zhì)無異于傳統(tǒng)茯磚，“菌花”香更為濃郁，此得益于人工大量接種純冠突散囊菌，本研究以此為基礎(chǔ)，配制單一基質(zhì)作為滿足冠突散囊菌生長繁殖的基本需求，同時分別添加已知濃度的生物堿單體成分，構(gòu)建茶葉生物堿單體成分-冠突散囊菌共培養(yǎng)發(fā)酵體系（10 d），考察冠突散囊菌對其的發(fā)酵特性，為進(jìn)一步豐富茯茶品質(zhì)形成機(jī)理提供理論依據(jù)。

3.2 咖啡堿是一類嘌呤類生物堿，是也茶葉特征性成分之一，占茶葉干重的2%～4%[17]。本研究以0.2 mg/mL的咖啡堿作為代謝底物添加到冠突散囊菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察咖啡堿與冠突散囊菌間相互影響，結(jié)果表明，該濃度的咖啡堿的添加對冠突散囊菌的生長繁殖，

pH值，剩余葡萄糖含量和總蛋白質(zhì)含量具有一定影響。咖啡堿的添加能在一定程度上刺激冠突散囊菌的生長，但在發(fā)酵過程中，其含量并未出現(xiàn)明顯變化，這說明在該發(fā)酵系統(tǒng)中，冠突散囊菌既不能將其作為碳源、氮源分解代謝來維持生長，也不能利用共培養(yǎng)發(fā)酵體系中其他成分來合成咖啡堿。該結(jié)果與前人研究基本一致，且研究表明微生物體系中，利用真菌分解代謝咖啡因遠(yuǎn)比細(xì)菌要難的多[18]，而且只發(fā)生在極少數(shù)的青霉屬和曲霉屬類群中，逐級代謝為茶堿和3-甲基黃嘌呤[19]。

3.3 可可堿與茶堿互為同分異構(gòu)體，是茶葉中除咖啡堿外兩種重要的生物堿，其添加與咖啡堿相似，能在一定程度上刺激冠突散囊菌的生長與繁殖，但不能將其作為碳、氮源消耗和分解，同時經(jīng)HPLC檢測分析，在可可堿、茶堿與冠突散囊菌的共培養(yǎng)發(fā)酵體系中均能檢測到少量咖啡堿，意味著冠突散囊菌可能具有將可可堿與茶堿作為前提合成咖啡堿的能力，本研究結(jié)果為后續(xù)研究可可堿、茶堿的具體轉(zhuǎn)化途徑及共培養(yǎng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化體系的進(jìn)一步優(yōu)化奠定了重要的前期基礎(chǔ)。